Sammendrag
I denne oppgaven ble det brukt b -glukan fra bygg produsert av Megazyme. Denne prøven ble kalt Ibh. Ibh ble karakterisert med hensyn til gjennomsnittsmolekylvekt og bindingsforhold. Videre ble prøven enzymbehandlet, hydrolysert og fraksjonert ved SEC-HPLC. For å undersøke effekten på prøvens molekylstørrelse på legumainaktivitet, ble makrofag cellelinjen (RAW 264.7-celler) stimulert med Ibh, enzymdegradert prøve (Ebh), hydrolyserte prøver og b -glukan standarder med molekylvekt i område 35-650 kDa. Resultater viste at Ibh, bestod av glukose og spor av mannose. Strukturen til Ibh var bygget opp av b -(1 à 4)- og (1 à 3) bundet glukoser. Til enzymdegradering ble det benyttet enzymet (endo-1 à 3(4)- b -glukanase) lichenase som degraderte prøven ved (1 à 4) bindinger og medførte til dannelse av oligosakkarider. Hydrolyse under milde betingelser førte til molekylvektsreduksjonen av Ibh. RAW 264.7 celler ble stimulert med Ibh og den enzymdegraderte prøven (Ebh), ved 0, 1 og 2 mg/ml konsentrasjoner. Resultater fra celleforsøk viste at enzymbehandlet b -glukan prøven hemmer legumainaktivitet. Ibh var dårlig løselig i forhold til Ebh, dermed viste den hemming av legumainaktivitet i mye mindre grad. Ebh ble behandlet med Polymyxin B for å undersøke om effekten på legumainaktiviteten var forårsaket av prøven eller LPS kontaminasjon. Polymyxin B tilsetningen påviste tilstedeværelse av LPS kontaminasjonen i prøven. Legumainaktiviteten økte ved stimulering med b -glukan standarder. Generelt sett var b -glukan standarder dårlig løselige, derfor ble prøvene varmebehandlet i 10-15 minutter før de ble benyttet til stimulering av cellemediet. Varmebehandlingen og at b -glukan standarder hadde lavt løselighet i cellemediet, gjør resultatene usikre. I tillegg ble det funnet LPS kontaminasjon i en av b -glukan standard prøvene. På grunn av mistanken om kontaminasjon av prøvene kan man ikke fastslå noen effekt av β-glukan fra bygg på legumainaktiviten, fordi det ikke er konstatert om det er β-glukanen som medfører til effekt på legumainaktiviteten eller om det rett og slett er forårsaket av LPS kontaminasjonen. Stimulering av RAW 264.7-celler med de hydrolyserte prøvene viste ingen effekt på legumainaktivitet . Den største hydrolyserte prøven hadde gjennomsnitt molekylvekt på 135 kDa og den laveste var på 9 kDa. Aktivitetene på begge prøvene tilsvarte kontrollnivået. Det ble ikke funnet klar sammenheng mellom molekylstørrelse og effekt på legumainaktiviteten. Ibh og b -glukan standarder ble videre testet for deres komplementaktiverings evne. Ibh viste et lavt komplement aktivitet via den klassiske aktiveringsvei. Standardene var stort sett uløselige i løsningsmidlet, som viste ingen og veldig lavt aktivitet. Det er påvist i litteraturen at b -glukan fra bygg har høyest affinitet til reseptorer CR3 og Dectin-1 på makrofag overflatereseptorer. Mekanismen bak hemming av legumainaktivitet er ennå ikke klarlagt, men det antas at binding av b -glukan til makrofag reseptorer fører til fagocytose. De fagocyterte b -glukan komponentene blir degradert til små og mer løselige fragmenter som kan være ansvarlige til denne hemmende effekten på legumain.