Sammendrag
Levende organismer er kontinuerlig utsatt for påvirkninger som kan skade DNA. Dette inkluderer oksidative DNA-skader som oppstår via normal metabolisme i cellene og fra en rekke miljøkjemikalier. Reparasjon av oksidative DNA-skader skjer hovedsakelig via baseeksisjonsreparasjon (BER). Dersom DNA-skadene ikke blir reparert, kan det føre til celletap eller mutasjoner. Oksidative DNA-skader er også assosiert med redusert spermkvalitet.
Genomets integritet i testikkelceller er svært viktig fordi cellene overfører informasjonen til neste generasjon. Genetisk skade i spermcellen kan medføre endringer i fosterutviklingen og sykdom i avkommet. Avdelingen hvor denne oppgaven utføres har foreslått miljøeksponeringer som en av årsakene til en observert redusert fertilitet hos menn. Avdelingen har tidligere vist klare forskjeller mellom mennesker og gnagere i evnen til å reparere visse typer oksidative DNA-skader i post-meiotiske og meiotiske kjønnsceller. Menneskets meiotiske og post-meiotiske testikkelceller hadde liten eller ingen evne til å reparere oksiderte puriner. Det er imidlertid lite kunnskap om DNA-reparasjon i spermatogonier og spesielt stamcellene i testikkelen. Dette er til dels fordi de har vært vanskelige å studere grunnet lavt antall testikkelceller i neonatale (nyfødte) gnagere, og svært lavt relativt antall spermatogonier i kjønnsmodne dyr. Testikkelcellene i neonatale dyr er spesielt interessante fordi deres mottakelighet og respons på DNA-skader legger grunnlaget for fertilitet resten av livet. Mitotiske spermatogonier og sertoliceller kan være mer utsatt for DNA-skade på grunn av sin lokalisering sammenliknet med meiotiske og postmeiotiske kjønnsceller som ligger innenfor blod-testikkelbarrieren. På grunn av sine roller som forløperceller bør de beholde sin genomiske integritet og det er antatt at neonatale spermatogonier og sertoliceller har funksjonell og effektiv reparasjon av DNA-skader. Sertoliceller har en sentral rolle som støtteceller for kjønnscellene og til tross for dette er DNA-skaderesponsen i aktivt delende sertoliceller i neonatale dyr et uutforsket område.
Hovedmålet for denne oppgaven er å bidra til god reproduktiv helse, ved å avklare mekanismer som har betydning for DNA-skader i testikkelceller. Økt kunnskap om testikulære spermatogonier (deriblant stamceller) og støtteceller (sertoliceller) i neonatale dyr vil bidra til dette målet. Vi har derfor studert effekten av oksidativt stress på DNA i disse celletypene. Dette ble utført ved å etablere en metode for enzymatisk isolasjon av testikkelceller fra 5-7 dager gamle mus. Deretter ble separate kulturer av spermatogonier og sertoliceller anriket. Cellene ble utsatt for oksidativ DNA-skade ved å eksponere dem for Ro 12-9786 sammen med synlig lys in vitro hvor 8-okso-7,8-dihydroguanin (8-oksoG) utgjør en stor andel av skadene. Denne spesifikke skaden ble kvantifisert ved bruk av enzymet Formamidopyrimidine DNA-glykosylase (Fpg) fra Escherichia coli (E. Coli) i kometmetoden. Reparasjonskapasiteten til celletypene ble studert ved å måle det gjenværende nivået av indusert oksidativ skade og skadenivå etter fem timer. Resultatene indikerer at neonatale spermatogonier og sertoliceller er like mottakelige for oksidative skader ved lav dose, men at sertoliceller akkumulerer DNA-skader ved høyere doser. Den manglende reparasjonen i sertoliceller ved høy eksponeringsdose kan skyldes en generell stressrespons eller en metning av reparasjonskapasiteten. Videre tyder resultatene på at neonatale spermatogonier har bedre kapasitet til å reparere oksidative DNA-skader enn sertoliceller. Redusert reparasjonskapasitet i neonatale sertoliceller vil gi konsekvenser for produksjon av modne kjønnsceller, siden de ikke får den støtten de trenger. Vår hypotese er at skadet DNA i neonatale spermatogonier og sertoliceller, samt tidlig tap av testikkelceller grunnet cytotoksisitet kan medvirke til nedgang i mannens fertilitet og økt forekomst av mutasjoner i sperm. I videre arbeid er det ønskelig å forfølge resultatene i denne masteroppgaven ved å studere responsen til neonatale testikkelceller i et miljø som reflekterer situasjonen in vivo.
Living organisms are continuously exposed to agents damaging their DNA. This includes oxidative DNA damage which results from both metabolism within the cell and exposure to a variety of environmental chemicals. Oxidative DNA damage is mainly repaired by base excision repair (BER). Absence of BER may lead to cell loss or mutation. From a male reproductive perspective oxidative DNA damage is shown to be linked to reduced sperm quality.
The integrity of DNA in testicular cells is considered important since these cells transfer information to the next generations. Genetic damage in the sperm cell may result in changes in the development of the fetus or in reduced offspring health. The Department of Chemicals and Radiation (MIKS) where this study was carried out, has suggested exposure to environmental chemicals as one causal factor with respect to men’s reduced fertility. The department has in previous studies shown a clear difference in human’s and rodent’s testicular cells concerning the ability to repair oxidative DNA damages in meiotic and post-meiotic male germ cells. Meiotic and post-meiotic testicular cells from humans showed little or no repair of oxidative purines. There is however very limited knowledge on DNA-repair in the progenitor cells, in spermatogonia and especially in the spermatogonial stem cells. The lack of knowledge can partly be explained by the very small relative number in mature rodents and the low number of testicular cells in neonatal rodents. The testicular cells in neonatal animals are especially interesting since their sensitivity towards, as well as their ability to repair and response to, exposure to DNA damage constitute a basis for the fertility of the male throughout life. Mitotic spermatogonia and Sertoli cells might be more exposed to DNA-damage due to their physiological location outside of the blood-testis-barrier compared to meiotic and post-meiotic germ cells which are located within this barrier. As a consequence of their role as precursor cells, neonatal spermatogonia and immature Sertoli cells are likely to have developed efficient systems to protect their genome integrity, of which one such defense system is functional and efficient DNA repair. Sertoli cells have a central role as nurturing and support cells to the male germ cells, and despite of this, the response to DNA damage in proliferating Sertoli cells is still largely unexplored.
The main goal in this project is to contribute knowledge to better take understand challenges concerning male reproductive health, by investigating mechanisms of DNA repair in testicular cells. To accomplish this we study the effect of oxidative stress in testicular spermatogonia (including stem cells) and the supporting cells (Sertoli) in neonatal animals. This was done by first establishing a method for enzymatic isolation of testicular cells from 5-7 day old mice. This was followed by enrichment of separate cultures of spermatogonia and Sertoli. Oxidative DNA damage was specifically induced by exposing the cells in vitro with a phototoxic compound Ro 12-9786 and light. The induced damage consists primarily of damaged
DNA bases such as 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxo-G) lesions. The DNA damage was quantified by including the Formamidopyrimidine DNA glycosylase (Fpg) in the single cell gel electrophoreses method, also known as comet assay. The relative repair efficiencies were calculated based on DNA lesion levels measured at the time of DNA damage induction (time=0) and after five hours of incubation to allow repair. The results indicate that spermatogonia and Sertoli cells from neonatal mice have similar sensitivity to oxidative damage at low doses, whereas Sertoli cells accumulate oxidative damage at higher doses. The higher doses may be cytotoxic to the Sertoli cells, and not to spermatogonia. Furthermore, the results indicate that spermatogonia have more efficient DNA repair compared to the Sertoli cells. Limited repair capacity in immature Sertoli cells can indirectly affect the production of mature germ cells, because if the limited DNA repair directs cell to rather be eliminated that repaired, there may be fewer Sertoli cells present in the testicle to support male germ cells. The observed decline in men’s fertility may be partly explained by damage to the DNA of both spermatogonia and Sertoli cells, including early loss of testicular cells caused by cytotoxicity. In further studies the results should be pursued in testicular cells kept within their normal physiological context in vivo.