Sammendrag
Erytropoietin fra human urin ble oppkonsentrert ved hjelp av ultrasentrifugering og karakterisert ved hjelp av SDS-PAGE, IEF og 2D elektroforese. 2D elektroforese separerer proteinene med hensyn på størrelse og ladning i samme system.
2D-systemet ble optimalisert med hensyn på IPG-stripsenes pH-intervall, behandlingen av stripsene, påsatt mengde erytropoietin og elektroblottingen. Det ble laget et detaljert krysseskjema for at ulike operatører skal kunne utføre metoden på likest mulig måte.
Ved 2D elektroforese ble det bekreftet at uhEPO har en rekke negative ladninger som ikke er tilstede på det rekombinante hormonet. Ved hjelp av trinnvis deglykosylering av uhEPO var målet å bestemme hvilke monosakkarider negativt ladde grupper er koblet til. Det ble vist at galaktoseenhetene innenfor sialinsyrene har negativt ladde grupper påkoblet, mens β-D-N-acetylglukosamin ikke ble vist å ha det. Ved sammenlikning av totalt deglykosylert uhEPO og rhEPO ble det konkludert med at negativt ladde grupper også er tilknyttet uhEPOs proteinkjede.
Fosfofarging direkte i gel viste at uhEPO er fosforylert. Human urin inneholder dessuten et ukjent fosforylert protein med størrelse liknende uhEPO, men med noe mer basisk pI. Det ble ikke påvist at shEPO er fosforylert, noe som kan tyde på at fosforyleringen som detekteres på uhEPO har fungert som en ”merkelapp” for utskillelse via nyrene i urinen.