Sammendrag
Den relativt nye prøveopparbeidelsesteknikken trefase væskefasemikroekstraksjon (LPME) ble prøvd ut som ekstraksjonsmetode for angiotensin I, II og III i kombinasjon med HPLC-UV og LC-MS. I peptidanalyse kombinert med LPME er det til nå bare kjent metoder for ekstraksjon av små modellpeptider i vann. Ekstraksjonsbetingelsene for angiotensinene ble optimalisert i vann og i humant plasma. Det ble også utviklet separasjonsbetingelser for angiotensiner i HPLC og LC-MS.
Peptidene ble ekstrahert fra vann eller plasma gjennom en porøs hulfiber impregnert med et organisk løsningsmiddel og over i en vandig, sur akseptorfase i fiberens hulrom. Forholdene i donorfasen og i akseptorfasen ble optimalisert slik at peptidenes vandring over den organiske membranen ble forbedret. Det ble særlig fokusert på pH i akseptorfase og donorfase slik at ny kunnskap om transporten av peptidene mellom de tre fasene kunne genereres. Optimal pH for ekstraksjonen ble funnet å være pH~1 i akseptor og pH~3 i donor. Det ble bekreftet at transporten er avhengig av en ionpardanner som danner hydrofobe komplekser med angiotensinene slik at disse blir hydrofobe nok til å diffundere inn i den organiske fasen. 1-heptansulfonsyre ble foretrukket som ionpardanner til kompleksdannelse med angiotensinene. n-oktanol ble benyttet som organisk fase. Beregnede utbytter ved LPME av peptidene under disse optimale forholdene var mellom ca 50 % (angiotensin II) og 80 % (angiotensin III). RSD lå i underkant av 10 % i disse ekstraksjonene.
Den optimaliserte metoden i vann ble overført til humant plasma. Peptidene ble ekstrahert fra plasma etter proteinfelling, pH-justering og tilsetning av ionpardanner. Det ble oppnådd utbytte på rundt 20 % for alle angiotensiner ved tilsetning av peptid før proteinfelling, og mellom 37 (angiotensin II) og 59 % (angiotensin III) ved tilsetning av peptid til supernatanten etter felling.
Akseptorfasene etter LPME i plasma ble også analysert på LC-MS, hvor en konsentrasjon av angiotensin II på 5 ng/ml i plasma var detekterbar.