Sammendrag
I denne oppgaven ble væskefasemikroekstraksjon (LPME) testet som prøveopparbeidelsesmetode for ekstraksjon av peptidene angiotensin I, II, III, angiotensin, II-antipeptid, vasopressin, endomorfin og enkefalin. Peptidenes egenskaper under ulike ekstraksjonsparametere ble studert og ekstraksjonsmetoden ble optimalisert. For å analysere prøvene ble det utviklet en HPLC-metode med gradienteluering der mobilfasesammensetningen bestod av acetonitril, vann, maursyre og 1-heptansulfonsyre. Det ble benyttet UV-detektor og C18 kolonne for deteksjon og separering av peptidene.
Peptidene ble ekstrahert fra en vandig donorløsning med et volum på 1 ml, gjennom en porøs hulfiber impregnert med organisk løsningsmiddel og ionpardanner, over i en 12 µl sur vandig akseptorløsning injisert inn i fiberens hulrom. Det ble benyttet ionparmediert-LPME i ekstraksjonene, med ionpardanner tilsatt til den organiske fasen. Denne teknikken ble utprøvd som ekstraksjonsmetode av peptider for første gang i denne oppgaven. Resultatene viste at ionpardanner tilsatt til organisk fase var like effektivt som ekstraksjoner utført med ionpardanner i donorfasen. Det ble i tillegg utført forsøk som beviste at ekstraksjonen var fullstendig avhengig av en ionpardanner.
Ulike ionpardannere, løst i ulike organiske løsningsmidler ble testet i oppgaven. Di(2-etylheksyl)fosfat (DEHP) og fargeindikatoren bromtymolblått ga de høyeste utbyttene i forsøkene. (Tridecylfosfat /TDP og bromfenolblått ga i tillegg brukbare utbytteresultater). Det ble eksperimentert med ulike organiske løsningsmilder som ketoner, alkoholer, etere som mulige organiske faser. 1-oktanol og 2-oktanon og diisobutylketon ga de beste utbytteresultatene i oppgaven. Det ble i tillegg gjort eksperimenter med ulike konsentrasjoner av ionpardanner i organisk løsning. Konsentrasjonene var mellom 5-20 % DEHP(Di(2-etylheksyl)fosfat ) i 1-oktanol. Det viste seg at ekstraksjonsutbyttene reduseres betydelig ved økende konsentrasjon av ionpardanner. De høyeste utbyttene var observert med 10% DEHP(Di(2-etylheksyl)fosfat).
Væskefasemikroekstraksjon av peptider er som kjent avhengig av pH og utbytteresultatene endrer seg ved endringer i pH. I oppgaven var det stort fokus på å undersøke peptidenes oppførsel ved pH-endringer i donor- og akseptorfase. De høyeste utbyttene ble observert ved pH~1 i akseptorfase og pH~3 i donorfase. Det ble også vist at utbytteresultatene for 5 av 7 peptidene økte ved økt ekstraksjonstid.
De høyeste utbytteverdiene for peptidene under optimale forhold var 80% angiotensin III, 70% for angiotensin I, II og angiotensin II-AP, 20% for vasopressin, enkefalin og endomorfin.
Den optimaliserte metoden med de beste ekstraksjonsforholdene ble testet ut på plasmaprøver. Prøveløsningene med plasma hadde ulike pH-verdier. Det ble utført ekstraksjoner med rent plasma (pH ~ 8), fotynnet plasma med destillert vann (pH ~7), surgjort plasma med HCl (med pH 3,5 og 4,0). Utbytteverdiene for 5 av 7 peptidene var rundt 10% ved pH 3,5 mens utbyttene gikk ned til 6-7 % ved økt pH (pH 4,0).
Ionpar-mediert LPME, der ionpardanner er løst i væskemembranen (organiske fasen) er som nevnt ikke blitt brukt før i forbindelse med ekstraksjon av peptider fra plasma. Det kreves mer forskning og flere eksperimenter for å optimalisere metoden ved ekstraksjon fra plasmaprøver.