Abstract
Adenomatous polyposis coli (APC) genet er uttrykt i de fleste vev og koder for et stort tumor supressor protein med mange funksjoner. Mutasjoner i APC er en av de tidligste årsakene til utvikling av både den arvelige typen av tarmkreft, familiær adenomatous polyposis (FAP) og spontan tarmkreft. De biologiske funksjonene til APC-proteinet er uklare, selv om mange proteiner som samhandler med APC er kartlagt.
En mutasjon i APC fører til aktivering av Wnt-reaksjonsveien noe som fører til akkumulering av β-katenin som kan translokeres til kjernen. Der virker den som en transkripsjonsfaktor og fører til transkripsjonsaktivering av en mengde proliferative gener
APC spiller også en viktig rolle i å regulere cytoskjelettet ved å stimulere Asef, en Rac-spesifikk nukleotid “exchange factor”. De fleste humane tarmsvulstene (85%) er i stor grad aneuploide og har dermed et unormalt antall kromosomer. Selv om man i mange år har visst at humane tumorer er hyppig aneuploide, var det først nylig det ble vist at dette skyldes en underliggende kromosom ustabilitet (CIN). Celler fra tarmsvulster er spesielt utsatte for kromosom ustabilitet (CIN). På tross av alminnelig forekomst i svulster, er mekanismene som bidrar til CIN lite forstått.
Trunkerte APC- mutasjoner har en dominant effekt som kan resultere i kromosom ustabilitet. Disse resultatene setter søkelys på at APC-mutasjoner kan ha onkogene egenskaper og at dette skyldes initiering av CIN, som igjen fører til akkumulering av andre mutasjoner, inkludert tap av det sekundære APC-allelet.
Dette kan ha betydning for reparasjon av DNA-skader, spesielt homolog rekombinasjon.
I denne masteroppgaven ble det benyttet humane embryo nyreceller (fra Storbritannia), HEK293, som var transfektert med APC- gen med tre ulike mutasjoner. Disse mutantene, N750, N1309 og N1807 ble alle uttrykt som Myc-proteiner og kodet for den første 750, 1309 og 1807 aminosyren av APC-genet.
Vi var interessert i å finne ut om HEK293-celler med og uten trunkert APC har ulik overlevelse etter behandling som øker DNA-skader. Og om trunkert APC påvirker dannelsen og reparasjon av DNA-skader i HEK293-celler.
Det ble først kjørt western for å påvise trunkeringene i cellene. Deretter ble overlevelse målt ved MTT-assay metoden etter eksponering med det DNA-skadelige stoffet MMS. Tilslutt ble det sett på DNA-reparasjon etter eksponering med MMS og Camp., og røntgenstråling og FPG-enzym ved hjelp av Kometmetoden.
Resultatene viste at HEK293-celler med normalt APC hadde lavere overlevelse enn celler med trunkert APC etter behandlet med det DNA skadelige stoffet MMS. HEK293 N750- cellene hadde lavest overlevelse av de trunkerte cellene, mens N1309- cellene hadde den høyeste overlevelsen. I tillegg viste kometmetoden at HEK293-celler med normalt APC fikk en raskere økning i dannelse av DNA skader med MMS og strålebehandling enn N750- cellene med trunkert APC.
Kometforsøkene tyder på at N750-cellene reparerer DNA-skadene noe langsommere enn HEK293-cellene med normalt APC. Dette underbygges av et høyere antall DNA-skader i de trunkerte N750- cellene over tid, og en større økning i DNA-skader ved behandling med Camp. Dette kan skyldes redusert reparasjon av DSB.