Sequential Assignment of the Heat-labile Enterotoxin Backbone for Lipopolysaccharide Interaction Studies

Abstract

Enterotoksigen E coli (ETEC) foråsaker alvorlig diaré, og er ansvarlig for millioner av dødsfall hvert år, hovedsakelig i utviklingsland. Hovedvirulensfaktoren til ETEC er det varmelabile enterotoksinet (LT), som er nært beslektet til koleratoksinet (CT), årsaken til kolera. LT består av en katalytisk aktiv subenhet som sitter på toppen av en smultringformet B-pentamer (LTB), ansvarlig for å binde toksinet til epitelceller i tarmen. B-pentameren har to bindingseter. Det primære bindingsetet binder til GM1 gangliosidet, som finnes på overflaten til epitelcellene. Nylig har et sekundært bindingsete blitt oppdaget på LTB isolert fra ETEC-stammer som rammer mennesker (hLTB), og dette bindingsetet binder blodgruppeantigener. Det er også vist at hLTB binder til lipopolysakkarider (LPS), som finnes på bakterieoverflaten. Denne bindingen ankrer LT til bakterieoverflaten og kan forklare hvorfor LT blir levert til vertscellen bundet til bakterielle membranvesikler, mens CT slippes fritt ut i tarmen. Tidligere forskning har forsøktå karakterisere bindingsegenskapene mellom LPS og LT, men denne gåten er fremdeles uløst. Målet med dette prosjektet er derfor å undersøke den spesifikke bindingen mellom LPS og hLTB ved å kombinere NMR-spektroskopi og røntgenkrystallografi. I denne oppgaven presenteres resonansassigneringen av hLTBs ryggrad . I prosessen har en forbedret protokoll av hLTB blitt utviklet og bakterien Vibrio sp. 60 har blitt tilpasset 99% D2O. Resonansassigneringen ble bekreftet ved å analysere bindingen av en kjent ligand, neolaktotetraose (NEO) til hLTB. Interaksjonen mellom hLTB og LPS ble komplisert grunnet den hydrofobe lipidhalen til LPS, som foråsaket aggregering. En løselig LPS-komponent, monosakkaridet Kdo, ble brukt til hLTB bindingsstudier. Ved å kombinere både NMR-assigneringen og krystallstrukturen ble det vist at det er lav-til-ingen binding mellom Kdo og hLTB. Fremgang har blitt gjort for å øke løseligheten til LPS ved å bruke forskjellige detergenter med en klar plan videre. Omfattende forberedende arbeid har blitt gjort for å studere bindingen mellom LPS og hLTB, og brøyter veiene videre for nye bindingstudier.

Enterotoxigenic E. coli (ETEC) cause severe diarrhea, killing millions of people every year, mainly in the developing world. The main virulence factor of ETEC is the heat labile enterotoxin (LT), which is closely related to the cholera toxin (CT), the causative agent of cholera. LT consists of a catalytically active A-subunit sitting on top of the doughnut-shaped B-pentamer (LTB), which is responsible for binding the toxin to the epithelial cells in the intestinal lumen. The B-pentamer has two recognized binding sites. The primary binding site binds to the GM1 receptor, presented on the epithelial cell surface. More recently, a secondary binding site, which binds to blood group antigens, was discovered on LTB that was isolated from ETEC strains infecting humans (hLTB). It has also been shown that hLTB binds to lipopolysaccharides (LPS) presented in the outer bacterial membrane. This binding anchors LT to the bacterial surface and may explain the different toxin delivery mechanisms between LT and CT, where LT is delivered to the host cell while bound to outer membrane vesicles, whereas CT is secreted in soluble form. Some research has been conducted to characterize the binding properties of LPS to LT, but the binding properties of the LPS binding site are still elusive. The goal of this thesis is to study the interaction between LPS and hLTB by combining NMR spectroscopy and X-ray crystallography. In this thesis, the resonance assignment of the hLTB backbone is presented. In the process, an improved production protocol of hLTB was developed, as well as adaptation of the bacterium Vibrio sp. 60 to 99% D2O concentrations. The resonance assignment was verified by the mapping of the primary binding site using a known ligand, neolactotetraose. The interaction between hLTB and LPS was complicated due to the hydrophobic nature of the LPS lipid tail causing aggregation. A soluble LPS component, Kdo monosaccharide, was used in the hLTB binding studies. Using both the NMR assignment and a crystal structure that was solved to 2.2 Å, we could show that there is low-to-none affinity between hLTB and Kdo. Progress has been made in solubilizing LPS using different detergents, with clear notions on which way to continue. Extensive work has been done to prepare for binding studies between LPS and hLTB, paving the road for future explorations of the interactions of these important biomolecules.