Liposomes as a model system for the study of surface active peptides

Abstract

Med den økende forekomsten av multiresistente patogene organismer er det et stort behov for alternativer til de konvensjonelle antimikrobielle medisinene som finnes på markedet i dag. Antimikrobielle peptider (AMPer) er lovende som utgangspunkt for å utvikle fremtidens antibiotika, men mer kunnskap om virkningsmekanismen deres er nødvendig for at dette skal være mulig. Det er kjent at peptidene interagerer med plasmamembranen til mikrobene og at denne interaksjonen er nødvendig for den antimikrobielle aktiviteten. For å undersøke disse lipidspesifikke interaksjonene til AMP ville vi bruke liposomer, sfæriske fosfolipidbilag, som etterlikner membranene til bakterier og pattedyr. Strukturelle endringer i bilaget ved tilsetning av peptid kan da karakteriseres. Lavvinkel røntgen/nøytronspredning (SAXS/SANS) er optimale teknikker for å undersøke endringene på nanoskala. Det er derimot funnet at liposomer alene feller ut i løsninger med AMPer, som gjør at det ikke er mulig å se den mikroskopiske virkningsmekanismen med disse teknikkene. Det trengtes derfor en metode for å stabilisere liposomene mot aggregering som fortsatt tillot peptidene tilgang til å påvirke membranen. I denne oppgaven har to typer polyetylenoksidderivater blitt testet for deres potensial for å stabilisere liposomer for AMP-indusert aggregering. Begge de modifiserte liposomsystemene sin kinetiske stabilitet, struktur og interaksjon ble testet, med og uten tilsatt AMP. I tillegg ble en kjent flokkulant, polyetylenimin (PEI) testet på systemet for sammenlikning med peptidet. Det ene systemet besto av å tilsette n-alkyl-polyetylenoksid (Cn-PEO) etter liposomene var blitt laget. For det andre systemet ble polyetylenoksidmodifiserte fosfolipider ("PEGylerte" lipider) inkludert i bilaget under preparasjonen. Begge metodene stabiliserte liposomene gjennom sterisk repulsjon. Selv om tilsetning av n-alkyl-polyetylenoksid gjør systemet mer fleksibelt når det kommer til tilberedning, ble det vist at Cn-PEO påvirker membranstrukturen til liposomene i stor grad. Ved 37 grader celsius løser Cn-PEO delvis opp bilager og lager blandede miceller med fosfolipidene, og de vekselvirker også med peptidene. De mange uønskede interaksjonene gir resultater som er vanskelige å analysere. De PEGylerte lipidene stabiliserte derimot liposomene uten å introdusere noen av disse uønskede effektene i systemet. Polymerne på overflaten påvirket heller ikke peptidet sin tilgang til membranen. For å kunne kvantitativt analysere data fra lavvinkelspredningen, ble analytiske spredningsmodeller utviklet både for liposomsystemet og for å beskrive innsetning av peptid i denne systemet. Disse modellene kunne beskrive de eksperimentelle dataene fullstendig. Et av de mer populære påstandene for AMPer er at de gjør membranen mer permeabel for vann og kan dermed utligne protongradienter. Det valgte modellsystemet ble derfor testet for tiden det tok for vann å utveksle over membranen ved å bruke SANS for å se om metoden kunne brukes til å studere effekten AMP har på vanntransporten. Fordelen SANS har over andre metoder som måler diffusjonen av vann er at man kan samtidig se endringer i struktur. Fullstendig utveksling av vann skjedde derimot raskere enn det som kunne måles for alle liposomene som ble testet. Dette skjedde uten tilsats av peptid som viser at lipid membraner er fullstendig permeabel for vann på eksperimentelle tidsskalaer.