Måling av DNA-skade i blod fra fisk ved bruk av comet assay

Abstract

Mange miljøgifter kan forårsake DNA-skade i akvatiske organismer, blant annet gjennom dannelsen av radikaler. En viktig type skade er DNA-trådbrudd, som kan kvantifiseres ved bruk av enkeltcelle-elektroforese, comet assay. Kunnskap om naturlige nivåer av skade i celler fra fiskeblod og mulighetene for å anvende comet assay med både røde og hvite blodceller er viktig for fremtidig overvåkning av gentoksiske effekter i akvatiske miljø. Formålet med denne oppgaven var å undersøke bakgrunnskade, reparasjon og betydningen av lagring av blod for DNA trådbrudd i helblod og hvite blodceller fra fisk. Arter som ble undersøkt var torsk (Gadus morhua) og regnbueørret (Oncorhynchus mykiss). Torsk er en økologisk og kommersielt viktig art som er mye brukt i miljøovervåkning i Norge. Regnbueørret har blitt mye brukt som modellorganisme i akvatisk økotoksikologi. Ubehandlet blod fra regnbueørret ble støpt i agarose på spesielle plastfilmer og oppbevart i >12 timer i lysisbuffer for undersøkelser av grunnleggende nivå av skade. Blod fra torsk ble støpt i agarose på spesielle plastfilmer og ubehandlede filmer ble oppbevart i >12 timer og 3 uker i lysisbuffer for kontroll og undersøkelser av lagring. To filmer ble eksponert for hydrogenperoksid og lagret i >12 timer og 3 uker i lysisbuffer for positiv kontroll og undersøkelse av lagring. Seks filmer ble inkubert i ulike behandlinger i forskjellige tidsintervaller (24 og 48 timer) for mulighet for reparasjon, og deretter oppbevart i lysisbuffer i >12 timer. Lave bakgrunnsnivåer av skade ble funnet for blodceller fra begge arter (<10 % DNA-skade). Sensitivitet for oksidativ skade ble undersøkt i røde og hvite blodceller fra torsk ved eksponering for hydrogenperoksid in vitro, og røde blodceller viste seg å være minst sensitive. Reparasjon av DNA ble undersøkt i helblod og hvite blodceller fra torsk og inkubering for reparasjon ga høyere skadenivåer enn peroksideksponering, med forskjeller mellom behandlingene, og 48 timer inkubasjon ga de høyeste nivåene av skade. Lagring av prøver i lysisbuffer viste at prøver kan lagres i minst 3 uker uten at det blir økt skade.