Utvikling av immunoassay for deteksjon av eksosomer

Abstract

Desto tidligere en kreftsykdom blir oppdaget, desto større er sjansen for overlevelse. De fleste kreftrelaterte dødsfall er forårsaket av metastaser. Det er derfor viktig å kunne detektere tilstedeværelse av disse så tidlig som mulig, og aller helst før de etablerer seg i nytt vev. De siste årene har det vært fokus på væskebiopsi, som betyr kreftdiagnostikk av sirkulerende celler, nukleinsyrer, proteiner eller vesikler. Stadig flere studier viser korrelasjon mellom ekstracellulære vesikler og spesifikke kreftdiagnoser. Dette gjør at ekstracellulære vesikler, spesielt eksosomer, kan være aktuelle biomarkører innen kreftdiagnostikk. Eksosomer er små vesikler (30 – 100 nm) med endosomatisk opprinnelse, som skilles ut fra alle typer celler ved at multivesikulære legeme (MVB) fusjonerer med plasmamembranen og frigjør intraluminale vesikler. Eksosomene inneholder proteiner, nukleinsyrer og lipider fra opprinnelsescellen, og de er funnet sirkulerende i alle kroppsvæsker. I dette prosjektet ble det utviklet et immunoassay for påvisning av eksosomer i cellekultursupernatant. Tetraspaninene CD9 og CD81 ble brukt i et generelt immunoassay og EpCAM i kombinasjon med enten CD9 eller CD81 i et mer spesifikt immunoassay. Med tanke på fremtidig bruk av et immunoassay innen diagnostikk, var parametere som tid og enkel håndtering viktige. Målet med utviklingen var å etablere et raskt, enkelt og automatiserbart immunoassay med tilstrekkelig signal til at eksosomer kunne detekteres. Ved å øke temperaturen fra 4 til 37 oC under oppbindingen av eksosomene så kunne inkuberingstider reduseres. Protokollen kunne forenkles ytterligere ved å fjerne vask mellom oppbinding av eksosomer og deteksjonsantistoff, noe som også gjorde protokollen mer automatiseringsvennlig. Total analysetid ble redusert fra rundt 20 timer til under 2 timer. I tillegg til bruk innen diagnostikk, kan immunoassayet være et nyttig verktøy innen optimalisering og standardisering av vekstbetingelser, tilsats av ulike faktorer i vekstmedium eller hvordan ulike behandlinger av celler påvirker uttrykket av bestemte overflatemarkører.