| dc.description.abstract | LC-MS-teknologien har enda ikke utviklet seg nok til å kunne detektere intakte proteiner og deres postranslationelle modifikasjoner (PTM), fra biologiske matrikser uten prøveopparbeidelse. Derfor benyttes fortsatt prøveopparbeidelsesmetoder, som bottom-up proteomikk, hvor proteiner blir klippet opp til mindre peptider forut for analyse. Denne strategien gir ofte god identifisering av proteiner uten PTM, men mindre god når proteinene er modifiserte, som blant annet kan skyldes variabilitet i polaritet og masse. I oppgaven ble det fokusert på N-glykosylering som PTM. Prinsippet var å se hvorvidt en enzymatisk fjerning av N-glykaner, ved hjelp av amidasen PNGase F, forut for proteolyse av proteinene, kan bidra til å gi høyere proteininformasjon av N-glykosylerte proteiner. Til proteolyse ble trypsin benyttet og som markørprotein ble glykoproteinet Fetuin A benyttet. Først ble Fetuin A i løsning, behandlet med PNGase F, for å måle deglykosylerings-effekten av enzymet. Deretter ble urinprøver spiket med Fetuin A prøveopparbeidet. Dette for å avdekke om prøvemediumet og prøveopparbeidelsesmetoden påvirket N-deglykosyleringen. Til slutt ble uspikede urinprøver behandlet med PNGase F, for å se N-deglykosylerings-effekten på N-glykosylerte endogene proteiner. Resultatene fra forsøkene viste at behandling med PNGase F forut for proteolyse ga flere identifiserte peptider og større aminosyresekvens coverage for N-glykosylerte proteiner, inkludert Fetuin A. I tillegg kan en konkludere med at PNGase F behandlingen er et ukomplisert tilleggssteg som krever lite ekstraarbeid og resulterer i sikrere identifisering av N-glykosylerte proteiner ved bottom-up strategi. | nor |