Abstract
Stadig flere lider av livsstilssykdommer som forkalkning av blodårene, diabetes og fedme. Disse lidelsene fører ofte med seg de to hovedårsakene for dødsfall blant menn og kvinner, nemlig hjerte- og karsykdommer, og kreft. Alle disse lidelsene og de dødelige sykdommene som følger med dem, kan før eller siden relateres til metabolisme, hvor tusenvis av proteiner og faktorer er involvert. Syklusene og interaksjonene innenfor metabolismen kan være svært komplekse, men bakom er genene som styrer alt. Lever X Reseptorer (LXR) er transkripsjonsfaktorer innenfor kjernereseptorfamilien. To isoformer av LXR har blitt identifisert, LXRα og LXRβ, med 78% likhet i proteinsekvensene i deres to ligand-bindingsdomener. Dyrestudier og in vivo studier har vist at manipulering av LXR ekspresjon har en effekt på de forventede sykdommene som aterosklerose, diabetes, inflammasjon, fedme, og overraskende nok også Alzheimers sykdom og visse typer kreft. De fleste ligander identifisert for LXR er endogene oksysteroler, noe som gjør LXR til ideelle farmasøytiske mål for medisiner mot metabolisme relaterte sykdommer. For strukturbasert drug design er det viktig å oppnå strukturer av de ligand-bindene domenene (LBD) i LXR med ligand. LBDene har blitt produsert, renset og krystallisert av flere grupper, men ingen strukturer av LXR LBD er løst der isoformene er bundet til samme endogene ligand. Målet med dette masterprosjektet var å rekombinant produsere, rense og krystallisere LXR LBD i kompleks med samme endogene og syntetiske ligander. Det var forventet at prosjektet skulle være ukomplisert, men det viste seg å ikke være tilfellet. Under produksjon av proteinene oppsto det mange problemer. De originale konstruktene gav lite eller ikke noe løselig protein under produksjon, men store mengder av protein i uløselige inklusjonslegemer. Vi forsøkte å variere kondisjonene og ha en ligand tilstedeværende i alle løsninger under ekspresjon, og transformere konstruktene inn i kuldetilpassede celler, men alle forsøk gav de samme resultatene med uløselig protein. Vi forsøkte dermed å rense protein fra inklusjonlegemene og folde proteinene in vitro. Dette resulterte i ustabile proteiner som ble utfelt ved konsentrering. Det proteinet renset fra den lille løselige fraksjonen ble brukt til krystalliseringsforsøk. Dette gav ingen krystaller, antageligvis på grunn av rensetag en som forsatt satt på proteinet. Rensetag en viste seg å være vanskelig å få av ettersom enterokinase er svært uspesifikk. Genene for LXR LBD ble klonet inn i en annen vektor som koder for periplasmisk ekspresjon.
More and more people suffer from lifestyle diseases, such as cardiovascular diseases, diabetes and obesity. All of these diseases are in some way related to metabolism. Thousands of proteins and factors are involved in metabolism, making the pathways and interactions extremely complex. However, underlying it all are the genes that are encoding the proteins involved. Liver X Receptors (LXRs) are transcription factors in the nuclear receptor family. The LXRs are sensors in the cell and are activated by binding metabolites from cholesterol, glucose and fatty acid metabolism, before binding a huge variety of genes encoding proteins involved in lipid homeostasis, thus regulating pathways and interactions. Two isoforms of LXR have been identified, the LXRα and LXRβ. Animal and cell studies have shown that manipulation of LXR expression has an effect on the expected diseases such as atherosclerosis, diabetes, inflammation and obesity, but also Alzheimer s disease and several types of cancer. Most of the ligands identified for LXRs are oxysterols, making LXRs ideal pharmaceutical targets for drugs against metabolic maladies. For structure-guided drug design it is important to obtain the structures of the LXR ligand-binding domains (LBD) with a ligand bound. The LBDs of the LXRs have been purified and crystallized by several groups, but no structures have been solved with both of the isoforms bound to the same endogenous ligand. The aim of this Master s project was to express, purify and crystallize the LXRs ligand binding domains alone and in complex with the same endogenous and synthetic ligands, to be ready for structural studies by X-ray crystallography. The project was expected to be straightforward, however this was not the case as several problems arose during the expression, purification and crystallization. The original construct yielded little or no soluble protein after harvest. We tried out different varying the conditions during expression, had a ligand present in all solutions and transformed the constructs into cold-adapted cells, but it yielded little to no soluble protein. The proteins were expressed in huge amounts, but in the form of inclusion bodies. We tried to purify the aggregated protein and refold the proteis in vitro, but the proteins aggregated when concentrated to a medium concentration. The small soluble fraction of proteins was purified and used for cleavage tests with enterokinase to cleave off the purification tag. Enterokinase turned out to be highly unspecific making the cleavage of the tag difficult. Crystallization trials were done with the tag still on, but did not yield any crystals. So we decided to clone the genes into a new vector, encoding periplasmic expression. Although the ultimate goal of the project never was reached, the road towards it has been highly educational.