Aktivitet av P-glykoprotein i mononukleære celler fra perifert blod

Abstract

Bakgrunn P-glykoprotein (P-gp), en adenosintrifosfat (ATP)-avhengig efflukspumpe, beskytter celler og vev i kroppen mot fremmedstoffer. P-gp er ikke bare lokalisert i kroppens mange overflater, som i tarmen og i blod-hjerne-barrieren, men også i lymfocytter. Immunsuppressive legemidler som ciklosporin og takrolimus har sitt virkested intracellulært i lymfocytter. De er substrater for P-gp, og det kan derfor tenkes at aktiviteten av denne pumpen kan være involvert i reguleringen av den intracellulære eksponeringen, og dermed også effekten av disse legemidlene. En høy aktivitet av P-gp i lymfocyttene vil motvirke distribusjonen av disse legemidlene til det intracellulære målmolekylet, og kan dermed føre til behandlingsresistens og økt fare for rejeksjoner. Hensikt Hensikten med dette arbeidet var å utvikle og validere en ex vivo metode for bestemmelse av P-gp aktivitet i lymfocytter fra transplanterte pasienter. Metode Humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert fra perifert fullblod (fra friske frivillige og organtransplanterte pasienter) ved tetthetsgradient-sentrifugering med Leucosep-rør. De isolerte cellene ble inkubert med det fluoriserende P-gp substratet rhodamin123 i et Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-medium i 30 minutter ved 37°C. Cellene ble så vasket to ganger med RPMI og 2% fetalt kalveserum (FCS), og deretter inkubert (60 minutter, 37°C) med eller uten en selektiv hemmer av P-gp (zosuquidar). Deretter ble cellene vasket med fosfatbufret fysiologisk saltvann (PBS) og 2% FCS, før fluorescens ble målt på en mikroplateleser (Victor ). P-gp aktivitet ble bestemt ved å beregne ratio av rhodamin123-fluorescens med og uten zosuquidar med tre paralleller. Resultater Innledende forsøk viste stor intra- og interdag variasjon på ferskt isolerte PBMC. Under metodeutviklings- og optimaliseringsprosessen ble følgende parametere undersøkt; type rør brukt til isolering av lymfocytter, antall vaskerunder og grad av retardasjon ved sentrifugering av PBMC. Sentrifugeringshastighet og konsentrasjon av P-gp hemmeren zosuquidar var de faktorene som hadde relevant innflytelse på aktivitetsmålingen. Endelig metode viser tilfredsstillende intradag- og interdag-variasjon, med variasjonskoeffisienter under henholdsvis 20% og 15%. Ratioer fra 1,1 til 1,6 er blitt bestemt for 4 ulike forsøkspersoner, noe som sannsynligvis reflekterer normal biologisk variabilitet i P-gp aktivitet mellom individene. Nyretransplanterte pasienter viste en P-gp aktivitet fra 1,3 til 2,0. Konklusjon Det er utviklet og optimalisert en metode til måling av P-gp aktivitet i PBMC med tilfredsstillende inter- og intradag variabilitet. Metoden er applisert på den relevante pasientpopulasjonen med tilfredsstillende resultater.

Background P-glycoprotein (P-gp), an adenosine triphosphate (ATP)-dependent efflux pump, protects cells and tissues in the body against foreign substances. P-gp is expressed not only in the body`s many surfaces, such as the intestine and the blood-brain barrier, but also in lymphocytes. Lymphocytes are the site of action for the immunosuppressive drugs ciclosporin and tacrolimus. They are substrates for P-gp, and it is therefore conceivable that the activity of the transporter may be involved in the regulation of the intracellular concentration and effect of these drugs. A high activity of P-gp in lymphocytes will inhibit the distribution of the drugs to their target and may therefore lead to resistance and higher risk for acute rejections. Aim The purpose of this master thesis was to develop and validate an ex vivo method for determination of P-gp activity in lymphocytes from organ transplanted recipients. Method Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated (from healthy volunteers and organ transplant recipients) by density centrifugation with Leucosep tubes. The isolated cells were incubated with rhodamine123 in a Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium for 30 minutes (37 °C). PBMCs were then washed twice with RPMI and 2% fetal calf serum, and incubated (60 minutes, 37 °C) with or without a selective inhibitor of P-gp (zosuquidar). PBMCs were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) and 2% fetal calf serum, and rhodmaine123 fluorescence was immediately measured on VictorTM. P-gp activity was determined by calculating a ratio for rhodamin123 fluorescence with or without zosuquidar in three parallels. Results Preliminary experiments showed large intra- and interday variability on fresh isolated PBMCs. Following parameters were examined during the development and optimization process; Type of tube used in the isolation of PBMCs, the number of washing steps and degree of deceleration during centrifugation. Centrifugation speed and concentration of the P-gp inhibitor zosuquidar were factors that had relevant influence on the activity measurements. The final method showed satisfactory intra- and interday variability with coefficient of variation below respectively 20% and 15%. Ratios for P-gp activity from 1.1 to 1.6 were determined for four different individuals, which probably reflect normal biologic variation between individuals. Renal transplant recipients showed a P-gp activity from 1.3 to 2.0. Conclusion A method for measuring P-gp activity in PBMCs has been developed and optimized. The method shows satisfactory inter- and intraday variability and has been applied on a relevant patient population.