CYP3A4-aktivitet ex-vivo i individuelle humane intestinale mikrosomer

Abstract

Introduksjon: Cytokrom P450 (CYP)-enzymet CYP3A4 er det kvantitativt viktigste CYP-enzymet i lever og tarm og er ansvarlig for metabolisme av over 50 % av alle legemidler. Resultater fra en studie i sykelig overvektige pasienter indikerer at det er en invers sammenheng mellom body mass index (BMI) og uttrykk av CYP3A4 i tarm og lever. Sykelig overvektige pasienter med ekstra høy BMI ser derfor ut til å ha økt risiko for overdosering av visse legemidler, spesielt hvis det doseres per kg kroppsvekt. Hensikten med dette arbeidet var å utvikle en metode for å preparere mikrosomer fra tarmbiopsier, fra en pasient, ved hjelp av homogenisering og videre isolering ved hjelp av subcellulær fraksjonering. Fenotyping av CYP3A4-aktiviteten ble bestemt ex vivo i disse individuelle humane intestinale mikrosomene (HIM) ved bruk av midazolam (MDZ) som probe. Metode: Biopsier fra jejunum fra en pasient inkludert i en tidligere klinisk studie ble homogenisert med Potter-Elvehjem- eller Dounce-homogenisator. Homogenatet ble sentrifugert i to omganger i ultrasentrifuge. Pelleten, som inneholdt mikrosomer, ble reløst i 0,25 M sukrosebuffer og fryst ned ved -70°C. I metabolismeforsøkene ble mikrosomer og homogenater (50 µL/rør) preinkubert ved 37°C i 118 mM Tris-H2SO4 (pH 7,4), 0,5 mM MgSO4 og 1,6 mM NADPH i 5-10 minutter. MDZ ble tilsatt i konsentrasjoner fra 0,5 til 20 µM, og prøvene ble inkubert i 7,5 minutter. Metabolismen ble terminert ved tilsetning av iskald acetonitril og inkubering på is i 30 minutter. Mengde 1-hydroksymidazolam (1´-OH-MDZ) dannet ble deretter bestemt ved en validert LC-MS metode. Enzymkinetiske analyser ble gjort ved hjelp av programvaren Graphpad Prism versjon 5. Resultater: Det ble påvist CYP3A4-aktivitet i både homogenater og mikrosomfraksjoner ved bruk av både Dounce- og Potter-Elvehjem-homogenisering. Mengden 1´-OH-MDZ dannet i mikrosomene og homogenat økte med økende mengde MDZ ved Michaelis-Menten lignende forløp. Noen av forsøkene fikk en bedre tilpasning med ligningen som beskriver substrathemming. Dounce- og Potter-Elvehjem-homogeniseringsmetodene ga mikrosom-fraksjoner med tilsvarende CLint-verdier, og homogenater fra de to metodene viste også tilsvarende evne til å metabolisere MDZ. Mikrosomfraksjonene dannet ved Potter-Elvehjem-homogenisator viste mindre variabilitet mellom forsøkene enn de som ble dannet ved Dounce-homogenisator. CYP3A4-aktivitet ble også påvist i mindre biopsier hvor Dounce-homogenisatoren ble benyttet på grunn av praktiske årsaker. Anrikningen i mikrosomfraksjonene i forhold til homogenatene tyder på en høyere spesifikk aktivitet i mikrosomfraksjonen. Dette gjaldt for de stor biopsiene korrigert for både totalprotein og CYP3A4, mens for de små biopsiene gjaldt det bare ved korrigering for totalprotein. Konklusjon: Det er utviklet metoder for homogenisering av tarmbiopsier fra en sykelig overvektig pasient og etterfølgende subcellulær fraksjonering av homogenat til mikrosomer, for måling av CYP3A4-aktivitet i disse. Begge homogeniseringsmetodene ga tilsvarende CLint-verdier i mikrosomfraksjoner og tilsvarende CLint-verdier i homogenat og er derfor egnet for homogenisering av store biopsier. Mikrosomfraksjonene ga høyere CLint-verdier for metabolisme av MDZ, og disse vil være best egnet til å studere CYP3A4-aktiviteten i studier med tilgang på store biopsier. Ved homogenisering av små biopsier må Dounce-homogenisator benyttes, og CYP3A4-aktivitet bør bestemmes direkte i homogenat. I kliniske studier med små og store biopsier er det da hensiktsmessig å studere CYP3A4-aktivitet i homogenater dannet ved Dounce-homogenisator.

Introduction: Cytochrome P450 (CYP)-enzyme CYP3A4 is the most abundant CYP-enzyme expressed in the human liver and intestine, and it is responsible for the metabolism of over 50 % of all drugs. Results from a study in obese patients indicate an inverse association between body mass index (BMI) and the expression of CYP3A4 in intestine and liver. Obese patients with high BMI might therefore be at risk of being overexposed to several drugs, especially if the drug is dosed based on body weight. The aim of this master thesis was to develop a method to prepare microsomes by homogenization and further subcellular fractionation of human intestinal biopsies. Phenotyping of CYP3A4-activity was determined ex vivo in individual human intestinal microsomes (HIM) with use of midazolam (MDZ) as probe. Method: Biopsies obtained from jejunum from one patient included in a previously preformed clinical trail was homogenized with either Potter-Elvehjem- or Dounce-homogenizer. The homogenate was centrifuged in two cycles in an ultracentrifuge. The final pellet, containing microsomes, was redissolved in 0.25 M sucrose and frozen at -70°C. In the metabolism studies microsomes and homogenates were preincubated at 37°C in 118 mM Tris-H2SO4 (pH 7.4), 0.5 mM MgSO4 and 1.6 mM NADPH for 5-10 minutes. MDZ was added in increasing concentrations (0.5-20 µM) and the samples were incubated for 7.5 minutes. The incubation was terminated by adding 150 µL ice-cold acetonitrile including internal standard and kept on ice for 30 minutes. The amount 1-hydroxymidazolam (1´-OH-MDZ) formed was analysed by a validated liquid chromatography with mass spectrometry detection method. Enzyme kinetics analyses were estimated by Graphpad Prism version 5. Results: The CYP3A4-activity was detected in both homogenates and microsomal fractions when using both Potter-Elvehjem- and Dounce-homogenizer. The formation of 1´-OH-MDZ increased with increasing amount of MDZ following the Michaelis-Menten model. The microsomes formed by Potter-Elvehjem-homogenizer showed less variability between the experiments than the microsomes formed by Dounce-homogenizer. This indicates that Potter-Elvehjem-homogenizer provides more reproducible results. Both homogenizing methods resulted in microsomal fractions with similar CLint-values, and homogenate from the two methods showed also similar ability to metabolize MDZ. The microsomes formed by Potter-Elvehjem-homogenizer showed less variability between the experiments than the microsomes formed by Dounce-homogenizer. The CYP3A4-activity was also detected in small biopsies, where Dounce-homogenizer was used for practical reasons. The enrichment in microsomal fractions relative to homogenates, indicate a higher specific activity in microsomal fractions. This was applied to the larger biopsies, corrected for both total protein and CYP3A4, while for the smaller biopsies this applied only by correction for total protein. Conclusion: Methods have been developed for homogenizing intestinal biopsies from one obese patient and subsequently subcellular fraction of homogenates to microsomes for studying CYP3A4-activity. Both homogenizing methods resulted in similar CLint-values for microsomal fractions and similar CLint-values for homogenates and they are therefore suitable for homogenizing larger biopsies. When homogenizing smaller biopsies Dounce-homogenizer must be used, and the CYP3A4-activity should be determined directly in the homogenate. In clinical studies with small and large biopsies it is convenient to study the CYP3A4-activity in homogenates formed by Dounce-homogenizer.