Èn skreddersydd immunocapture-LC-MS/MS-metode for diagnose av småcellet lungekreft : Multipleksing og differensiering av ProGRP- og NSE-varianter

Abstract

Småcellet lungekreft er den mest aggressive formen for lungekreft med en overlevelsesrate på mindre enn 5 % etter 5 år. Sykdommen responderer imidlertid godt på behandling hvis initiert på et tidlig stadium. Det er derfor viktig å utvikle gode diagnostiske verktøy som tillater tidlig diagnose og behandlingsmonitorering. Sammen med røntgen og CT-scanning kan bruk av spesifikke og sensitive biomarkører for småcellet lungekreft bidra til dette.

Neuronspesifikk enolase (NSE) er den mest etablerte biomarkøren for småcellet lungekreft. Samtidig bestemmelse av progastrinfrigjørende peptid (ProGRP), som er en lovende biomarkør for differensiert diagnose av småcellet lungekreft, vil være mer nøyaktig da ProGRP viser høyere sensitivitet og spesifisitet enn NSE. Begge proteinene bestemmes i dag separat ved bruk av immunometriske metoder. Disse metodene er imidlertid utsatt for kryssreaktivitet som kan resultere i falske positive og -negative resultater, i tillegg til at de ikke skiller mellom de ulike isoformene av proteinene.

Hensikten med denne oppgaven var å fusjonere to tidligere utviklede validerte metoder for deteksjon av ProGRP og NSE til én enkelt metode uten å påvirke resultatene som metodene gir separat. Begge metodene involverer immunoaffinitetsekstraksjon og ”bottom-up” LC-MS/MS-analyse. En metode som tillater samtidig bestemmelse av ProGRP-isoformer og NSE-isoenzymer, vil være en arbeidsbesparende metode som tillater differensiert bestemmelse av to komplementære biomarkører for småcellet lungekreft.

For å evaluere den nye metoden ble det i denne oppgaven utført en grundig sammenligning av den fusjonerte metoden og de separate metodene. Forsøkene som vil bli presentert viser at de endrede forholdene ved fusjoneringen fortsatt gir god reproduserbarhet og utbytte. Forsøkene viser følgende effekter av endrede forhold; 1) det relative utbyttet av de respektive markørene ble ikke påvirket ved addisjon av ulike magnetiske kuler til varierende spikede løsninger, 2) reduksjon, varme og alkylering før tryptisk proteolyse ga økt signalintensitet for samtlige signaturpeptider sammenlignet med ingen pre-tryptisk behandling, 3) ProGRP- og NSE-konsentrasjoner ble sammenlignet ved varierende konsentrasjon av den andre markøren der en uparet t-test viste ingen signifikant forskjell i målt signalintensitet som tilsier at ProGRP- og NSE-konsentrasjoner kan bestemmes uavhengig av hverandres konsentrasjon, 4) kalibreringskurver for samtlige signaturpeptider ble harmonisert i serum hvilket tillater samtidig bestemmelse av ukjente ProGRP- og NSE-konsentrasjoner i pasientprøver.

Vellykket fusjon av de to metodene for ProGRP og NSE, inkludert deres isoformer og isoenzymer, viser at metoden gir pålitelig bestemmelse og differensiering av klinisk relevante nivåer av to etablerte, komplementære biomarkører for småcellet lungekreft. Ved analyse av pasientprøver med den fusjonerte metoden ble resultatene funnet sammenfallende med eksisterende immunometriske assays og dette bekrefter at metoden kan være et egnet diagnoseverktøy for småcellet lungekreft.