Utvikling av en kvantitativ proteomikkmetode for P-glykoprotein i mononukleære celler fra perifert blod

Abstract

Introduksjon: Ulik funksjon av legemiddeltransportører kan gi opphav til interindividuell variasjon i legemiddelrespons. ATP-bindende kassett (ABC)-transportøren P-glykoprotein (P-gp) uttrykkes blant annet i ulike blod-vevs barrierer, tarmen, nyrene, leveren og i lymfocytter. Transportøren påvirker opptak og distribusjon av en rekke legemidler og innen enkelte terapiområder resulterer dette i legemiddelresistens. For ulike immunosuppressiva hindres distribusjon til det intracellulære målmolekylet, og dette kan føre til behandlingsresistens og økt fare for rejeksjon hos transplanterte pasienter. Å kunne kvantifisere transportøren er av interesse, men er per dags dato ikke utført i humant vev ved hjelp av LC-MS/MS. Hensikten med denne oppgaven var å utvikle en kvantitativ proteomikkmetode til å måle protein-uttrykket av P-gp i mononukleære celler fra perifert blod (PBMC). Metode: Til metodeutvikling ble en standard av cellemembraner fra insektsceller transfektert med humant ABCB1 (P-gp, MDR1) benyttet. Innledningsvis ble homogenisering utført ved bead-beating (Precellys® 24). Prøvene ble deretter renset ved immunoekstraksjon (IP) med magnetiske kuler (Dynabeads®) og en kombinasjon av to ulike antistoff mot P-gp, UIC-2 som interagerer med proteindelen på utsiden av membranen og JSB-1 som interagerer med proteindelen på innsiden. Effekten av ulike surfaktanter (digitonin, natrium deoxycholat og PPS Silent®) på IP og proteolyse ble undersøkt. Trypsin ble benyttet for proteolyse av proteiner som ble utført etter standardprotokoll; 2 timer eller over natten inkubering etter reduksjon og alkylering med 10 mM ditiotreitol og 50 mM jodeddiksyre. Videre opprensing av prøven ble utført ved fast-fase-ekstraksjon med C8 materiale. Signaturpeptidet (AGAVAEEVLAAIR) ble målt ved hjelp av LC-MS/MS der responsen for dette representerte mengde P-gp i prøven. Resultater: Utbyttet av P-gp i standard økte fra omtrent 3% opptil 36% av utbyttet ved direkte proteolyse, da antistoffet ble bundet til P-gp før de magnetiske kulene ble tilsatt (indirekte IP). Under IP ble det vist at kombinasjon av de to antistoffene (0,5 μg + 0,5 μg) ga omtrent tre ganger høyere utbytte enn ved bruk av JSB-1 alene (0,5 μg) og 60% høyere enn ved UIC-2 alene (0,5 μg). Bruk av 0,3 μg av hvert antistoff ble vist å være optimalt for 0,2 μL standard da ulike konsentrasjoner ble undersøkt. I tillegg ble det vist at tilstedeværelse av 200 μg/mL digitonin under IP økte utbyttet med 23%, i forhold til IP uten digitonin. Homogenisering ved bead-beating (Precellys® 24) der antistoffene ble tilsatt forut for behandlingen, ga utbytte av P-gp fra standard, og økt homogeniseringstid ga også økt utbytte av P-gp. Konklusjon: Det har blitt utviklet en metode for å detektere P-gp i membraner fra transfekterte insektceller. Videre arbeid med optimalisering av metoden er nødvendig, før vellykkede analyser av lave nivåer av transportøren i PBMC kan utføres.