Cellulære effekter av et kolkisin-prodrug som spaltes av legumain

Abstract

Legumain er en lysosomal endopeptidase som normalt er uttrykt i mange humane vev. Studier har imidlertid vist at uttrykket av legumain er oppregulert i kreftsvulster, og at legumain kan være involvert i metastasering og invasivitet ved kreft. Grunnet substratspesifisiteten legumain har for å spalte peptidbindinger karboksyterminalt for asparagin (Asn), kan legumain være et interessant enzymatisk mål innen kreftbehandling. Kolkisin er et trisyklisk alkaloid som ekstraheres fra planten Colchicum automnale. Planten har vært brukt som medisin i århundrer, blant annet i behandlingen av urinsyregikt. I de senere årene har virkningsmekanismen av kolkisin vært i fokus, og bruk innen flere forskjellige terapeutiske områder har vært vurdert. Grunnet evnen kolkisin har til å binde mikrotubuli og dermed hemme mitose, har kolkisin vist et potensiale innen kreftterapi. For å unngå den generelle toksisiteten har et prodrug (Suc-Ala-Ala-Asn-Val-kolkisin) som spaltes av legumain blitt syntetisert. I denne studien ble effektene av dette prodruget undersøkt og sammenlignet med kolkisin og kolkisin-valin (-Val) Humane nyreceller fra embryo (HEK293-celler), en monoklonal stabil legumaintransfektert HEK293-cellelinje (M38L) og tykktarmskreftcellelinjen HCT-116 ble brukt som cellemodeller. Celleviabilitet etter behandling med kolkisin, kolkisin-valin og kolkisin-prodrug ble målt ved hjelp av tetrazoliumsaltet MTS. For å verifisere at effekten av prodruget kommer av prodrug-spaltning utført av legumain, ble cellene inkubert med legumainhemmeren cystatin E/M ved behandling med kolkisin-prodrug. I tillegg ble cellene behandlet med endocytosehemmeren Dyngo4a for å undersøke om kolkisin-prodrug ble tatt opp i cellene ved endocytose. Caspasehemmeren biotin-VAD-fmk ble tilsatt for å undersøke om denne kunne beskytte mot effektene av kolkisin-prodrug. Aktivitet av legumain ble målt ved bruk av et spesifikt fluorescerende peptidsubstrat og proteinuttrykk av legumain og caspase-3 ble undersøkt ved immunoblotting. Celleviabilitetsmålinger viste at konjugering med den aktuelle peptidsekvensen reduserte effekten av kolkisin i HEK293. Celler som overuttrykte legumain (M38L) viste seg derimot å være sensitive for behandling med kolkisin-prodrug, mens tilsetning av cystatin E/M beskyttet cellene mot kolkisin-prodrugets effekter. Dette bekrefter teorien om at spaltning av prodruget ble utført av legumain og styrker muligheten for målstyring av cytostatika til kreftsvulster med høyt uttrykk av enzymet. Legumainaktiviteten ble redusert ved behandling med de forskjellige kolkisinforbindelsene hvor kolkisin ga størst og kolkisin-prodrug minst effekt. I tillegg kan det se ut til at endocytose spiller en rolle i opptaket av kolkisin-prodrug i celler.