Legumain i samspillet mellom tykktarmkreftceller og makrofager

Abstract

Legumain, en asparaginyl endopeptidase, er uttrykt i de fleste normale humane vev, men proteasen er overuttrykt i faste svulster, blant annet ved tykktarmkreft. Tumorassosierte makrofager (TAMs) overuttrykker legumain, og det er nylig vist at hemming av TAMs reduserer tumorvekst og angiogenese. Legumain finnes både intracellulært i lysosomene og bundet til integriner på celleoverflater, men kan også skilles ut fra celler som overuttrykker legumain. Endopeptidasen prosesserer og/eller aktiverer andre proteaser som bryter ned ekstracellulær matriks, som pro-MMP2 og cathepsiner. Disse proteasene er assosiert med økt cellemigrasjon og invasivitet, og høyt uttrykk av legumain er forbundet med dårlig prognose. Legumain i samspillet mellom makrofager og kreftceller ser derfor ut til å spille en viktig rolle i utviklingen av kreft. Dette samspillet er nylig vist for andre cysteinproteaser som cathepsin B og S ved brystkreft. I denne oppgaven undersøkes makrofager og tykktarmkreftceller hver for seg og i kokultur, med spesielt fokus på legumain. I tillegg studeres legumain og viabilitet av cellene etter påvirkning av paklitaksel, en cytotoksisk tubulinhemmer.

Humane HCT-116-tykktarmkreftceller og PMA-differensierte THP-1-makrofager ble hovedsakelig brukt som cellemodeller. Kondisjonert cellemedium ble samlet etter henholdsvis 4 dager for HCT-116, og etter 3-6 og 6-10 dager (etter PMA-behandling) for THP-1, og brukt som reagens i indirekte kokultur. Legumain ble analysert med enzymaktivitetsmålinger ved hjelp av et spesifikt fluorescerende peptidsubstrat, og celleviabilitet ble målt med MTS, både i indirekte og direkte kokulturer. Etter inkorporering av [3H]-tymidin ble cellemigrasjon studert ved brønninnlegg med og uten Matrigel og beregnet ved å telle radioaktivitet av merkede, migrerte celler i en scintillasjonsteller.

Resultatene viste en doseavhengig reduksjon i celleviabilitet av både tykktarmkreftceller og makrofager etter stimulering med paklitaksel (1-500 nM) når cellene ble behandlet hver for seg. Tilsvarende direkte kokulturinkubering førte derimot til økt celleviabilitet sammenliknet med ubehandlet kokultur. Videre var det en tendens til økt legumainaktivitet i tykktarmkreftceller som ble stimulert med kondisjonert medium fra makrofager, og redusert legumainaktivitet i makrofager dyrket i kondisjonert medium fra tykktarmkreftceller. Det ble også observert en tendens til økt motilitet av tykktarmkreftceller i nærvær av makrofager, mens det ikke var forskjell i cellenes evne til invasjon gjennom Matrigel.

Resultatene indikerer at makrofager skiller ut faktorer som fører til økt legumainaktivitet og økt motilitet av tykktarmkreftceller. Disse observasjonene, samt økt celleviabilitet av kokulturen etter behandling med paklitaksel bekrefter et samspill mellom celletypene, men mekanismene som er involvert er ukjente og må undersøkes nærmere.