Perilipin-2s rolle i fettsyre- og glukosemetabolisme i skjelettmuskel : Studier på muskelceller fra Plin2-knockout-mus

Abstract

Innledning: Skjelettmuskulaturen er det største vevet i menneskekroppen og er ansvarlig for mesteparten av lipidoksidasjonen og insulin-stimulert glukoseopptak og utnyttelse. Endringer i lipid- og glukosemetabolismen i skjelettmuskel spiller en viktig rolle i utvikling av insulinresistens, og dermed vil økt innsikt i energiomsetning i skjelettmuskelen kunne gi en bedre sykdomsforståelse. Utviklingen av insulinresistens er blitt koblet opp mot økt akkumulering av fettsyrer i skjelettmuskel (ektopisk lipidakkumulering). I de senere årene har det blitt avdekket at intramyocellulære lipiddråper spiller en viktigere rolle i lipidmetabolismen enn tidligere antatt. Effektiv lagring av FFA i disse lipiddråpene antas å forebygge mot utvikling av insulinresistens i skjelettmuskel. Regulering av fettsyreopptak og lagring i tillegg til lipolyse av triglyserider fra de intramyocellulære lipiddråpene foreslås å være nøye regulert av bla. lipiddråpeassosierte proteiner. En av de lipiddråpeassosierte proteinene, perilipin-2 (Plin2), er høyt uttrykt i skjelettmuskel. Vi har på bakgrunn av dette studert rollen til perilipin-2 i lipid- og glukosemetabolismen i skjelettmuskel ved å sammenligne myotuber fra Plin2-knockout- og villtypemus.

Metode: Kulturer av prolifererte satelittceller (myoblaster) fra Plin2-knockout- og villtypemus ble opprettet. Myoblastene ble differensiert til flerkjernede myotuber før det ble utført forsøk på dem. Myotubene ble forbehandlet 24 timer med ulike konsentrasjoner av oljesyre, GW501516 (PPARδ-agonist) og GW7647 (PPARα-agonist). Det ble benyttet substratoksidasjonsassay for å undersøke fettsyre- og glukosemetabolismen i myotubene. For å studere fettsyre- og glukosemetabolismen ble cellene inkubert i 4 timer med enten [1-14C]oljesyre eller [14C(U)]glukose +/- oljesyre eller mikondriell frikobler FCCP. Akkumulering og lipolyse av [14C]oljesyre ble studert ved hjelp av ”scintillation proximity assay” over tid med forskjellige oljesyrekonsentrasjoner. Real-time qPCR ble benyttet for å studere effekter på Plin3- og Plin5-mRNA-uttrykk hos Plin2-villtype- og Plin2-knockoutmyotuber.

Resultater: Oljesyreopptak og oksidasjon var signifikant lavere hos Plin2-knockoutmyotuber sammenlignet med villtypemyotuber. Samtidig viste resultatene et lavere glukoseopptak, akkumulering og oksidasjon av glukose hos Plin2-knockoutmyotuber i forhold til Plin2-villtypemyotuber. Til tross for dette, ble det observert en lignende suppresjon av glukoseoksidasjon av oljesyre mellom Plin2-knockout- og Plin2-villtypemyotuber. Basal- og total lipolyse av oljesyre var ikke signifikant forskjellig mellom donorene. Stimulering av cellene med en PPARδ-agonist (GW501516) gav økt oljesyreoksidasjon i Plin2-villtypemyotuber, mens ingen endringer i oljesyreoksidasjon ble observert hos Plin2-knockoutmyotuber.

Diskusjon/konklusjon: Resultatene tyder på en lavere energimetabolisme (energibehov) hos Plin2-knockoutmyotuber, og dermed en lavere total energimetabolisme i myotubene. Plin2 kan være involvert i en energisløsende mekanisme (”futil sykling”) via fettsyre-triglyserid-syklus. I tillegg viste resultatene at PPARδ er involvert i fettsyreoksidasjon i skjelettmuskel hos mus, trolig blant annet ved å oppregulere Plin2-uttrykk.

Introduction: Skeletal muscle is the largest tissue in the human body and is responsible for most of the lipid oxidation and insulin-stimulated glucose uptake. Changes in lipid- and glucose metabolism in skeletal muscle plays an important role for the development of insulin resistance, thus further insight into glucose and lipid metabolism in skeletal muscle could provide better insight into this disease condition. The development of insulin resistance has been linked to excessive storage of fatty acids in skeletal muscle (ectopic lipid accumulation). In recent years it has been revealed that intramyocellular lipid droplets plays an important role in lipid metabolism. Effective storage of free fatty acids in lipid droplets is believed to prevent insulin resistance in skeletal muscle. Fatty acid uptake and storage, including lipolysis of triacylglycerol from intramyocellular lipid droplets, are carefully regulated by lipid droplet associated proteins. One of the known lipid droplets associated proteins is perilipin 2 (Plin2) and its highly expressed in skeletal muscle. Based on these reports we studied perilipin 2’s role in lipid- and glucose metabolism in skeletal muscle by comparing myotubes from Plin2 knock out- and Plin2 wild type mice.

Methods: Cultures of proliferated satellite cells (myoblasts) from Plin2 knock out- and wild type mice were created. Satellite cells were differentiated to multinucleated myotubes before experiments were carried out. Myotubes were pretreated for 24 hours with different concentrations of oleic acid, GW501516 (PPARδ agonist) and GW7647 (PPARα agonist). Substrate oxidation assays were used to examine fatty acid- and glucose metabolism in the cells. To monitor fatty acid- and glucose metabolism, cells were incubated for 4 hours with [14C]oleic acid or [14C]glucose +/- oleic acid or the mitochondrial uncoupler FCCP. Accumulation and lipolysis of [14C]oleic acid were studied with scintillation proximity assay (SPA) over time with different concentrations. To explore effects on Plin3 and Plin5 mRNA in Plin2 wild type and knock out Plin2 cells, we used qPCR.

Results: Oleic acid uptake, accumulation and oxidation were significantly lower in Plin2 myotubes knock out compared to Plin2 wild type myotubes. The results also showed a lower uptake, accumulation and oxidation of glucose in Plin2 knock out myotubes compared to Plin2 wild type myotubes. Despite this, a similar suppression of glucose oxidation by oleic acid was observed. Both basal lipolysis and total lipolysis of oleic acids was not found to be significantly different between the donors. In addition, stimulation with a PPARδ agonist (GW501516) caused an increased oleic acid oxidation in Plin2 wild type myotubes, while no changes in oleic acid oxidation was observed in Plin2 knock out myotubes.

Discussion/Conclusion: The results suggest a lower energy metabolism/requirement in Plin2 knock out myotubes, hence a lower total energy metabolism. Results from this thesis suggest that Plin2 could be involved in fatty-triacylglycerol futile cycling. In addition, results showed that PPARδ is involved in fatty acid oxidation in skeletal muscle of mice probably by upregulation of Plin2.