Effekt av alginat på legumain, en protease involvert i kreftutvikling

Abstract

Bakgrunn: Alginat er en kjent polymer som har vært mye utnyttet kommersielt, men også i legemiddelbransjen de siste årene. Alginat er et løselig kostfiber som gir immunrespons ved cellestimulering. Mange studier har vist en tendens til at kosthold med mye kostfiber gir lavere insidens tykktarms-endetarmskreft. En tidligere masteroppgave ved forskningsgruppen har vist at legumainaktivitet ble påvirket av alginat ved in vitro eksperimenter, både ved direkte autoaktivering prolegumain og ved stimulering av makrofagceller. Denne oppgaven bygget videre på dette og effekten av alginat på legumain ble nærmere studert, der legumain er en cysteinprotease som har vist relasjon til kreftutvikling. Metoder: Det ble brukt forskjellige metoder for å karakterisere alginat M-60 med innhold av 60 % mannuronsyre og M-100 med 100 % mannuronsyre. Monosakkaridsammensetningen til disse alginatene ble bestemt ved metanolyse, GC, og NMR og de ble også redusert for å bestemme ladningenes betydning. Det ble utviklet en metode for å fremstille så ren alginatoligomere som mulig, ved anvendelse av alginatlyase for å degradere alginatet og deretter fraksjonering av prøvene på ionebytterkolonnen. Fraksjonene ble videre analysert på HPLC, HPAEC-PAD og MS for å bestemme størrelsen til oligomerene. Ikke redusert- og redusert M-60 og M-100, alginatlyasebehandlet M-60, og i tillegg M-75 og M-94 ble videre testet for evne til å påvirke legumainaktivitet. To ulike forhold ble studert; Stimulering av makrofager (RAW 246.7-celler) i kultur eller direkte inkubering av prolegumain sammen med de ulike alginatprøvene for å undersøke deres evne til å stimulere autoaktivering av prolegumain. Resultat: NMR-metode gav en mer nøyaktig bestemmelse av monosakkaridsammensetning til alginat i forhold til GC-metoden. Alginatdegraderingsprosessen ved behandling med alginatlyasen ble vellykket med i både buffer og vann, og vann ble derfor benyttet for å slippe å gjøre desalting. Ved direkte autoaktivering prolegumain gav de ubehandlede alginatene M-60, M-75, M-94 og M-100 øking i legumainaktiviteten. Alginat M-100 og M-94 gav mest stimulering av prolegumain autoaktivering med 7 ganger høyere legumainaktiviteten enn kontroll, mens M-60 gav 6 ganger høyere og M-75 gav 5 ganger høyere legumainaktivitet. Reduserte M-100 ga ingen stimulering av legumain autoaktivering, mens redusert M-60 og M-60 ikke fjernet borat gav 5 ganger høyere legumainaktivitet. Sammenlignet med kontrollen gav lyasebehandlet M-60-fraksjoner B2 og C4 ingen effekt, mens fraksjon B3 gav 20 % høyere og fraksjon C5 gav 40 % høyere legumainaktivitet ved autoaktiveringsforsøk. I celleforsøk gav ubehandlet alginat M-60 veldig varierende resultater. I to forsøk stimulerte den økning legumainaktivitet, men i et forsøk gjorde den ikke. M-75 og M-94 gav en hemmende effekt, der M-75 gav 50 % og M-94 gav 90 % lavere legumainaktivitet enn kontroll. M-100 gav ingen effekt. Reduserte M-60 og M-100 og de lyasebehandlede-M-60-fraksjonene gav en hemmende effekt av legumainaktivitet. Redusert M-100 gav 30 % mindre legumainaktivitet enn kontroll, men M-60 gav 50 % mindre aktivitet. Lyasebehandlet M-60- fraksjon gav 10-30 % lavere legumainaktivitet enn kontroll.