Robusthetstesting av kapillærkolonner fylt med polybutadien-modifiserte zirkonia partikler og partikulære og monolittiske poly(styrendivenylbensen) materialer for anvendelse innen temperatur-programmert mikro-HPLC

Abstract

A method for packing 3 micron polybutadien (PBD) coated ZrO2 particles in a 0.5 mm ID x 10 cm long capillary column has been developed. The method gave columns with efficiency values slightly lower than 100.000 N/m. The method failed to give equal values for longer or more narrow bore columns. Columns packed according to this method were examined using high temperature or temperature programming. The packed bed shrinked during use above 100 °C, but investigations carried out using SIM or ICP-AES did not show evidence of particle distruction. It was therefore concluded that a rearrangement of the packed bed had taken place. The columns was subjected to several temperature programs up to 100 °C and thereafter filled with fresh material before further investigation was carried out. After more than 3900 temperature programs up to 100 °C, the column still had its separation power intact, even though efficiency value and retention factor had decreased. PS-DVB capillary columns filled with particles or monolithic structure was also tested at higher temperature and temperature programming, and this column material was found to be temperature stable after passing through 7500 void volume of mobile phase at 100 °C and 130 °C respectively. The monolithic columns were more robust and tolerated higher temperatures than the particle packed columns. The monolithic columns had to be tested using 2 % les acetonitrile and 0.1 % higher TFA content, but this hardly explains the different robustness. It is reasonable to believe that the monolithic structure swell less than the particle packing, and this might be part of the explanation. It was found that temperature programming in RP-LC using PS-DVB materials is effective, assuming that the needed concentration range is not to wide. The experiment showed that gradient elution is a more effective elution tool for separation of proteins than temperature programming, and it is therefore recommended that temperature programming is used as a supplementary tool for selectivity tuning. The different stationary phases tested for use with temperature programming showed limitations towards higher temperatures, but they all are far better alternatives than the silica based materials.

Det er blitt utviklet en pakkemetode for 3 mikrometer polybutadienbelagte (PBD) ZrO2 partikler i en 0,5 mm ID x 10 cm kapillærkolonne som gav effektivitetsverdi i underkant av 100.000 N/m. Pakking av lengre og/eller trangere kolonnedimensjon gav dårligere resultat. ZrO2 kapillærkolonner pakket etter den utviklede metode ble testet ved høye temperaturer og ved temperaturprogrammering. Partikkelmassen krympet i lengderetningen ved temperaturer/temperaturprogrammering over 100 °C, og det ble konstatert ved hjelp av SEM-mikroskopi og ISP-AES at partiklene ikke gikk i oppløsning. Følgelig ble det fastslått at høy temperatur og/eller temperaturprogrammering gav opphav til omstrukturering av pakkematerialet. Kolonnene ble utsatt for en rekke temperaturprogrammer opp til 100 °C og deretter etterfylt med pakkemateriale før robusthetstestingen ble utført. Etter at kolonnene hadde vært utsatt for 3900 temperaturprogrammer opp til 100 °C, viste separasjonsevnen seg å være inntakt for de utvalgte modellsubstanser, selv om kolonnen hadde fått reduksjon i effektivitet og retensjonsfaktor. Partikulære og monolittiske PS-DVB kapillærkolonner ble også testet ved høye temperaturer og under temperaturprogrammering, og de ble funnet å være temperaturstabile etter at 7500 void volumer av mobilfase hadde passert kolonnene ved henholdsvis 100 °C og 130 ˚C. Monolittkolonnene ble funnet å være mer stabil enn de partikulære kolonnene. Stabiliteten på monolittiske kolonner ble testet med 2 % mindre AcN og 0.1 % høyere TFA i mobilfasen, men det er tvilsomt at dette forklarer forskjellen som ble påvist. Det er rimelig å anta at den monolittiske strukturen ikke sveller i samme grad som partiklene og dette kan ha betydning. Generelt ble det funnet at temperaturprogrammert RP-LC på PS-DVB materialer er effektivt, dersom det nødvendige konsentrasjonsområdet for å oppnå tilstrekkelig elueringskontroll ikke er for stort. Imidlertid viste undersøkelsen at gradienteluering er et mer effektivt verktøy ved separasjon av proteiner enn temperaturprogrammering, og følgelig bør temperaturprogrammering benyttes som et supplerende verktøy for å oppnå større grad av selektivitetskontroll. Stasjonærfasene som her er utprøvd ved høye temperaturer og under temperaturprogrammering viste seg å ha klare begrensinger i temperaturtoleranse, men de er allikevel klart bedre alternativer enn de silikabaserte materialene.