Mitokondriell heterogenitet i nevronkulturer : Separasjon av mitokondrier fra lillehjernen hos rotte, kylling og mus ved sentrifugering for studie av funksjonelle forskjeller

Abstract

Mitokondriell dysfunksjon er sentralt i nevronal celleskade og ved nevrodegenerative sykdommer. Mitokondrier er heterogene og finnes i subpopulasjoner med funksjonelle forskjeller. Subpopulasjoner av mitokondrier antas å bidra ulikt i prosesser som fører til celleskade. Glutamat er involvert ved nevronal skade og død, for eksempel slag, og eksponering av cellekulturer for glutamat brukes i studier av celledødsmekanismer. Det er ved mikroskopiteknikker vist at mitokondrier i rottekornceller reagerer ulikt etter glutamateksponering, og variasjon i respons er knyttet til mitokondrienes lokalisering i cellen. For å kunne studere funksjonelle forskjeller mellom mitokondrielle subpopulasjoner i nevronkulturer, var det derfor ønskelig å utvikle en metode for fysisk å kunne separere mitokondrier.

Til denne studien ble det brukt kornceller fra lillehjernen hos rotte, kylling og mus. Det ble utviklet en metode for separasjon av mitokondrier ved differensiell sentrifugering med hastigheter svarende til 750 g, 3000 g, 6000 g og 10000 g. Metoden ble validert ved bruk av fire teknikker for måling av mitokondrieinnhold: fluorescensmerking med MitoTracker®, sitratsyntaseaktivitetsmåling, Westernanalyse av HSP-60 og PCR-basert deteksjon av mitokondrielt DNA. Det ble vist at mitokondrier ved denne type separasjon i størst grad fordeler seg på de to tyngste fraksjonene, med mindre bidrag i de to letteste.

Det ble deretter undersøkt effekter av glutamateksponering av korncellekulturene. Korncellekulturene ble inkubert i to timer etter glutamateksponering. Det ble først testet om glutamateksponering førte til en annen fordeling av mitokondrier i fraksjoner etter sentrifugering. Det ble vist at fordelingsmønsteret ikke ble endret etter glutamateksponering. Videre ble det testet om det kunne sees forskjeller mellom sentrifugeringsfraksjonene med tanke på DNA-replikasjon, DNA-reparasjon målt ved aktivitet av enzymet AP endonuklease og ROS-produksjon. Glutamateksponering nedsatte DNA-replikasjon signifikant i både rotte- og kyllingkornceller, og DNA i de ulike sentrifugeringsfraksjonene var rammet i ulik grad. Glutamateksponering av kyllingkornceller induserte økt ROS i en av sentrifugeringsfraksjonene der mindre tette mitokondrier forventes å pelletere ned.

Det kan være en sammenheng mellom grad av ROS-nivå, nedgang i DNA-replikasjon og nivå av DNA-reparasjonsenzym. Forskjellene som ble sett mellom sentrifugeringsfraksjonene er i tråd med antakelsen om at subpopulasjoner av mitokondrier er funksjonelt ulike. Flere studier av dette kan bidra til å øke vår forståelse av om hvorvidt ulike typer mitokondrier er involvert på ulikt vis i sykdomsprosesser som fører til nevronal død.