Aktivering av c-Jun NH2-terminal kinase i hepatocytter i primærkultur : effekter av ulike agonister og mulige signalmekanismer

Abstract

Vasopressin (VP), angiotensin II (Ang II), noradrenalin (NA) og prostaglandin E2 (PGE2) er eksempler på agonister som aktiverer Gq-proteinkoblede reseptorer i dyrkede hepatocytter fra rotte. Dette fører til aktivering av fosfolipase C (PLC) og nedstrøms økning av intracellulært kalsium (Ca2+) og aktivering av protein kinase C (PKC). Mekanismene for aktivering av c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) med agonister som aktiverer G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) i hepatocytter er lite undersøkt. Hovedmålet med denne oppgaven var derfor å kartlegge hvordan GPCR-agonister aktiverer JNK i hepatocytter. Det ble hovedsaklig fokusert på PLC-signalveien, og hvilken rolle Ca2+ og PKC spiller i aktivering av JNK med disse agonistene. En annen målsetning med oppgaven var å undersøke effekter av epidermal vekstfaktor (EGF) på JNK-aktivitet.

Hepatocyttene ble i de fleste forsøkene dyrket i 5 timer før de ble inkubert med forskjellige agens. Aktivering av JNK ble bestemt ved henholdsvis Western blotting og immunpresipitering og kinase-assay. Deteksjon av fosforylert JNK ved Western blotting ble utført ved bruk av et spesifikt antistoff mot dobbeltfosforylert (aktivert) JNK1 og JNK2, mens et antistoff mot total JNK ble brukt som en ”loading”-kontroll. Ved immunpresipitering og kinase-assay ble det utført immunpresipitering av JNK1 med påfølgende deteksjon av det [32P]-fosforylerte JNK1-substratet c-Jun (som blir et mål på JNK1-aktivitet) ved autoradiografi.

Alle agonistene stimulerte JNK-aktivering. Resultatene viste at både VP, Ang II, NA, PGE2 og EGF kan stimulere JNK-aktivitet, og at VP førte til kraftigst aktivering blant disse agonistene. EGF førte til en forholdsvis langvarig aktivering av JNK. Thapsigargin, som fører til en økning i intracellulært Ca2+ ved å hemme Ca2+-pumpen sarcoplasmatisk eller endoplasmatisk retikulum Ca2+-ATPase (SERCA), og 12-O-tetradecanoylforbol-13-acetat (TPA), som fører til direkte aktivering av PKC, stimulerte også JNK-aktivering. Den thapsigargin-induserte aktiveringen av JNK var mye kraftigere enn effekten av TPA og agonistene som aktiverer GPCR. Effekten av TPA og av alle agonistene unntatt VP på aktivering av JNK ble svakt hemmet ved chelatering av ekstracellulært Ca2+ med EGTA, mens effekten av VP ikke ble påvirket. Effekten av thapsigargin, derimot, ble kraftig hemmet. Hemming av PKC med GF109203X endret ikke thapsigargin-indusert aktivering av JNK, mens effekten av VP ble noe økt. Effekten av TPA ble imidlertid fullstendig hemmet. Mens både EGTA og GF109203X førte til en svak økning i basal JNK-aktivitet, førte BAPTA-AM (som chelaterer intracellulært Ca2+) til en såpass kraftig økning i den basale aktiviteten at det ble vanskelig å tolke resultatene. Preinkubering med MEK-hemmeren U0126 hemmet både VP- og thapsigargin-indusert JNK-aktivitet. EGF stimulerte JNK-aktivitet i minst 5 timer både 5 og 24 timer etter utsæd av cellene.

Konklusjon: Økt nivå av intracellulært Ca2+, indusert med thapsigargin, ga en kraftig stimulering av JNK-aktivitet i hepatocyttene. Direkte aktivering av PKC med TPA aktiverte JNK, men i mindre grad. Verken økt intracellulært Ca2+ eller aktivering av PKC ser ut til å mediere effekten av VP på JNK-aktivitet i hepatocyttene.