Bruk av atomkraftmikroskopi i studiet av molekylære strukturer i den opportunistiske, patogene bakterien Bacillus cereus

Abstract

Sammendrag

Restriksjons- og modifikasjonssystemer er bakteriens beskyttelsesmekanismer mot fremmed DNA. Systemene består av to typer enzymer: modifikasjonsenzymer som gjenkjenner og metylerer sekvenser på eget DNA mot restriksjon. Restriksjonsenzymer setter seg på sekvenser på DNA som mangler denne spesifikke merkingen og klipper i disse sekvensene. Det er viktig at systemet fungerer optimalt slik at ikke enzymene tilintetgjøre sitt eget DNA. Type III R M system finnes kun hos noen få bakterier og i 1992 ble det påvist i Bacillus cereus ATCC 10987.

Vi ønsker å benytte Atomkraftmikroskopi (AFM) til å studere egenskaper hos modifikasjonsenzymet Type III i B. cereus ATCC 10987 og samtidig studere bindingen til DNA. AFM kan blant annet brukes til å studere biologiske materialer som DNA og proteiner. Teknikken er så følsom at det tillater å komme ned i mikroskala nivå der molekylære detaljer av biologiske preparater kan studeres. AFM- mikroskopet lager bilder ved at en meget fin stift beveges over preparatet. Metoder som måling av høyde og bredde av DNA og modifikasjonsenzymet ble utført for å identifisere enkelt komponentene.

pUC ble brukt som DNA materiale og det ble utviklet ulike metoder for prøvebearbeidelse for å oppnå den ønskete formen av DNA som er egnet til visualisering og måling ved AFM. DNA trådens form, buffere, pH, innstillinger av instrumentet var noen av punktene som det arbeidet iherdig med for å oppnå vellykket skanning. Modifikasjonsenzymet merket med 6 x histidin ble uttrykt i E. coli og samlet opp med Ni - NTA- kolonne og detektert med SDS - polyakrylamid gelelektroforese.

DNA- materialet og proteinet ble videre undersøkt med AFM for å studere deres strukturer og målinger ble utført. Resultatene ble sammenlignet med andre arbeid og viste tilnærmet god overensstemmelse. Innenfor hovedfagets tidsramme ble det ikke anledning til å arbeide videre for å finne bindingssekvensen til modifikasjonsenzymet.