Utvikling og testing av en metode for å måle PKA-avhengig spermiebevegelse

Abstract

Utvikling av nye, effektive metoder innen mannlig prevensjon har fått høy prioritet innen World Health Organization Task Force grunnet overbefolkning, fattigdom og nød. Det er hittil forsøkt utvikling av hormonbasert prevensjon, men på bakgrunn av problematisk bivirkningsprofil er flere av disse trukket tilbake så sent som i klinisk fase 3. Det er tidligere vist at proteinkinase A (PKA) er involvert i regulering av spermiebevegelse og syntese av ATP hos spermier fra mus. PKA er et holoenzym bestående av en regulatorisk (R) dimer og to katalytiske (C) subenheter. I spermier er det kun identifisert en C-subenhet som er betegnet CαS. Spermiespesifikk CαS har en unik N-terminal peptidsekvens som kan være av biologisk betydning. Når CαS blir fjernet ved genetisk nullmutasjon i mus blir hannmusene 100 % infertile. Sekvensen av CαS i menneske og mus er svært like. Det er derfor antatt at CαS i menneske og mus har samme funksjon og at human CαS derfor regulerer mannlig befruktningsevne. Basert på dette er det en hypotese at human CαS kan være et målmolekyl for stoffer som kan påvirke CαS sin funksjon og dermed spermiebevegelse. Det er antatt at slike stoffer kan utvikles til mannlige prevensjonsmidler. For å kunne identifisere ulike stoffers evne til å hemme spermiebevegelse var utgangspunktet for denne oppgaven å utvikle en enkel og reproduserbar biologisk metode for å måle spermiebevegelse, samt å benytte en biokjemisk metode som måler ATP-nivåer som et mål på spermieaktivitet. Den biologiske metoden omfattet anrikning, sulting, demembranering og reaktivering av spermier. Måling av spermiebevegelse ble gjort ved hjelp av CASA (Computer Assisted Semen Analysis) og viste at peptider fra den N-terminale enden av CαS ikke regulerte spermiebevegelse med reproduserbar virkning. Derimot, viste vi at H89, KT5720 og PKI som alle er hemmere av CαS reduserte motilitet. Ved bruk av den biokjemiske metoden viste vi i tillegg en nedgang i nysyntese av ATP ved tilsetting av CαS-hemmerene og tyrosinkinasehemmeren SU6656. Våre resultater på humane spermier samsvarte med tidligere analyse på spermier isolert fra mus. Dette tydet på at metodene som ble benyttet var CαS-spesifikke og viste at human CαS kan være et mål for stoffer som kan brukes til å regulere spermiebevegelse og dermed mannlig befruktningsevne.