Abstract
Etter transplantasjon av celler, vev eller organer, er det alltid en risiko for rejeksjon. Ved rejeksjon avstøtes det transplanterte vevet eller organet på grunn av en immunreaksjon hos mottakeren. Dette fører til at transplantatet etter en tid opphører å fungere, og brytes ned. For å unngå rejeksjon er det nødvendig å hemme mottakers immunsystem, og dette gjøres med immunsuppressiv behandling. Det finnes en rekke immunsuppressive legemidler på markedet, og behandlingen foregår etter bestemte behandlingsprotokoller.
Glukokortikoider og mykofenolat utgjør en sentral del av de fleste immunsuppressive behandlingsregimer. På bakgrunn av dette skal det i denne hovedfagsoppgaven utvikles en LC-MS/MS-metode for å kvantifisere glukokortikoider og mykofenolsyre (MPA) i humant plasma. Et av formålene med å utvikle denne metoden er i senere studier å undersøke aktiviteten av de to isoenzymene hydroksysteroid (11-beta) dehydrogenase 1 og 2 (HSD11B1 og HSD11B2), som spiller en viktig rolle i aktivering og inaktivering av glukokortikoider in vivo. Siden de fleste transplanterte pasienter i dag står på et doseringsregime bestående av både glukokortikoider og mykofenolat, kan det være hensiktsmessig også å inkludere MPA i den samme analysemetoden som glukokortikoidene.
Analysemetoden baserer seg på bruk av væskekromatografi koblet til tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Kromatografisk separasjon skjer ved hjelp av HILIC-prinsippet (hydrofil interaksjonskromatografi). Mobilfasen som benyttes er en gradient av
95 % acetonitril og vann bufret med 10 mM ammoniumacetat og 0,2 % maursyre. Med denne gradienten separeres analyttene fra øvrige matrikskomponenter, og total analysetid per prøve er 6 minutter. Flumetason og prednisolon-d6 er valgt som interne standarder.
Positiv elektrosprayionisering (ESI+) brukes som ioniseringsteknikk, og protonerte molekylioner [M+H]+ brukes til monitorering, med unntak av MPA, der ammoniumadduktet brukes. Monitoreringsteknikken baserer seg på MRM (multippel reaksjonsmonitorering).
Prøveopparbeidelsen består av proteinfelling med acetonitril og væske-væske-ekstraksjon med diklormetan. Etter ekstraksjonen dampes prøvene til tørrhet under nitrogengass, og løses på nytt i acetonitril.
Innen-serie- og mellom-serie-presisjon for hver av analyttene ble evaluert i en pool av pasientprøver, som ble fortynnet til tre ulike konsentrasjonsnivåer. Innen-serie-presisjonen var for de fleste analyseseriene akseptabel. For en del av analyseseriene, da spesielt ved de laveste konsentrasjonene, var variasjonskoeffisienten for høy. Når det gjelder mellom-serie-presisjonen var også variasjonskoeffisienten for høy, og må forbedres.
Ved hovedfagets slutt er ikke metoden ferdig utviklet. Foreløpig ser metoden lovende ut for kvantifisering av glukokortikoider. Til tross for at nedre kvantifiserbare grense (LLOQ) ikke er bestemt ennå, ser det ut til at alle glukokortikoidene er målbare og kvantifiserbare ved analyse av pasientprøver. Noe som tyder bra, da pasientprøver gjenspeiler klinisk relevante konsentrasjoner som det senere er aktuelt å måle. Men enkelte parametere bør optimaliseres, før en full validering gjennomføres. Hvorvidt metoden er egnet til å analysere MPA er fortsatt noe usikkert, men det skal jobbes det videre med.