| dc.description.abstract | Bacillus cereus-gruppen er en undergruppe av Bacillus-slekten, og omfatter de fleste av de patogene Bacillus-arter, selv om patogenisitet også har vært vist i andre Bacilli. Enkelte bakteriestammer i B. cereus-gruppen kan danne biofilm, som er en tilstand hvor bakteriecellene er tett sammenpakket, løst bundet til hverandre, og vanligvis festet til en fast overflate. Bakteriecellene holdes sammen av en ekstracellulær matriks hvor polysakkarider er en viktig komponent. Matriksen kan blant annet gi beskyttelse mot antibiotika og immunsystemet under en infeksjon. Det er kjent at biofilmdannelse kan være en patogenisitetsfaktor i flere patogene bakterier. I genomet til B. cereus ATCC 14579 er det beskrevet en region som koder for proteiner (BC5263-5279) som tidligere er foreslått å være involvert i polysakkarid kapsel-syntese. Sekvensering av B. cereus ATCC 10987 har identifisert et lignende lokus i den tilsvarende posisjon i kromosomet (BCE5380-BCE5400), som også kan kode for et mulig ekstracellulært polysakkarid (EX-lokus). Verken B. cereus ATCC 10987 eller B. cereus ATCC 14579 er imidlertid vist å kunne danne kapsel. I motsetning til B. cereus ATCC 14579 er imidlertid B. cereus ATCC 10987 vist å kunne danne biofilm i et PVC mikrotiterplate-basert assay, en prosess som krever syntese av den ekstracellulære polysakkaridmatriks. Tidligere komparative genomanalyser hadde vist at EX-lokus i B. cereus ATCC 14579 og B. cereus ATCC 10987 kodet for separate putative polysakkarid polymerase- og transportgener som ikke var beslektet i primær-sekvens. Gitt at disse to stammene viste meget ulik evne til biofilmdannelse, kunne det være en mulighet at dette var forårsaket av de ulike subtypene av polymerase- og transportproteiner sin evne til å bidra til ekstracellulær polysakkarid-syntese, for eksempel ved forskjeller i substrat-spesifisitet. I dette arbeidet har vi screenet 78 stammer i B. cereus-gruppen for nærvær av homologer til putative polysakkarid polymerase- og transport-gener (BCE5386 og BCE5389) fra EX-lokuset i biofilmdanneren B. cereus ATCC 10987, ved isolering av genomisk DNA, Southern blotting og DNA-hybridisering. Screeningen ble utført for å undersøke en eventuell korrelasjon mellom nærvær av ortologer til de spesifikke polysakkarid polymerase- og transportgener identifisert i B. cereus ATCC 10987 i de 78 stammene, og evne til å danne biofilm i de samme stammene (resultat fra separat hovedfagsoppgave). Resultatet av screeningen viste at genene var unike for B. cereus ATCC 10987 og korrelerte dermed ikke med evne til å danne biofilm, da B. cereus- og B. thuringiensis-stammer som var vist ikke å ha ortologer til BCE5386 og BCE5389, allikevel var effektive biofilm-dannere. BCE5386 og BCE5389 er derfor ikke essensielle for evne til biofilmdannelse i B. cereus, men man kan allikevel ikke utelukke at de deltar i prosessen i B. cereus ATCC 10987.
For å undersøke hvorvidt lignende eksopolysakkaridloki var tilstede i flere stammer, gjorde vi en komparativ sekvensanalyse av ortologer til alle gener i EX-lokuset fra B. cereus ATCC 10987, i de andre komplett sekvenserte stammer i B. cereus-gruppen (B. cereus ATCC 14579, B. cereus E33L, B. thuringiensis serovar konkukian 97-27 og B. anthracis Ames). Resultatene av analysen viste at det var stor stammevariasjon i dette lokuset, spesielt med hensyn på de sentrale regionene hvor polysakkarid polymerase- og transportprotein kodes. B. thuringiensis serovar konkukian 97-27, som var negativ for biofilmdannelse i tidligere assays, hadde et lignende EX-lokus som B. cereus ATCC 10987 og B. cereus ATCC 14579, men igjen var de sentrale deler av lokuset unikt for denne stammen. Enkelte stammer manglet EX-lokus i denne regionen av kromosomet (B. cereus E33L, B. anthracis Ames), men er funnet å ha mulige alternative loki for ekstracellulær polysakkaridsyntese i andre kromosomregioner. Det er uvisst om disse stammene kan danne biofilm.
I samarbeid med Michel Gohar ved INRA, Frankrike utførte vi innledende undersøkelser av en delesjonsmutant i EX-lokuset i B. thuringiensis 407, som viser nedsatt og endret biofilmdannelse (kornete makroskopisk morfologi), for å kontrollere at mutanten var en sann delesjonsmutant. Sekvensanalyse av B. thuringiensis 407 ΔEX i dette arbeidet viste at erytromycinkassetten var klonet inn i korrekt posisjon i det genetiske konstruktet benyttet til konstruksjon av ΔEX-mutanten. Resistenskassetten er satt inn i kromosomet ved enkel eller dobbel overkrysning, men ytterligere undersøkelser ved DNA-hybridisering er nødvendig for å kunne bekrefte at delesjon av EX-lokus har funnet sted, og at det er disse genetiske endringene som forårsaker biofilm-fenotypen. | nor |