Strategi for utvikling av LC-MS metode som diagnostisk verktøy for kvantifisering av tumormarkøren NSE i humant plasma

Abstract

For å utvikle en metode som gjør det mulig å kunne foreta en kvantitativ bestemmelse av NSE i humant plasma ved hjelp av LC-MS, er det nødvendig å legge opp en strategi for optimalisering av proteinkromatografi og -deteksjon i komplekse prøvematrikser. Inngående kunnskap om fordelene ved å jobbe med peptider fremfor proteiner, ligger til grunn for den proteolytiske klippen av målproteinet. Videre arbeides det med peptidprodukter som er spesifikke for målproteinet.

NSE ble klippet med proteasen trypsin i vandig løsning, og peptidløsningen ble analysert. Peptidprodukter ble identifisert, og flere peptider ble verifisert ved MS-MS. Det ble satt 4 kriterier som grunnlag for å velge ut de beste peptidene til å representere NSE. Alle identifiserte peptider ble testet mot disse. Peptidproduktene ble testet for spesifisitet i forhold til andre plasmaproteiner. Deretter ble dannelsen av peptidprodukter monitorert over tid for å finne de peptidene som når optimalt endepunkt for den tryptiske klippen. Intensiteten som peptidene forekommer i ble vurdert. Det er avgjørende at den tryptiske klippen genererer peptider med høy signalintensitet. Dette vil gi lave deteksjonsgrenser. Retensjonen av peptidene på kolonnen ble evaluert som den siste avgjørende faktoren. Fire peptider ble på dette grunnlaget valgt ut som de beste kandidatene for deteksjon av NSE i prøver.

Som et ledd i prøveopparbeidelsen av plasmaprøver, ble fellingsprofilen til NSE kartlagt. Felling med ulike mengder ACN i vandig prøve ble utført. Best fellingsresultat for NSE ble oppnådd med 50 % ACN. Samme forsøket ble utført i spikede plasmaprøver og det ble bekreftet at felling med 50 % ACN var det mest egnede fellingsforholdet.

Til slutt ble den utviklede metoden for bestemmelse av NSE i humant plasma applisert på plasmaprøver fra pasienter med påvist småcellet lungekreft. Konsentrasjonen av NSE i disse prøvene var på forhånd bestemt av Det Norske Radiumhospitalet til 235 μg/L. Resultatene viste tydelig spor av NSE i pasientprøvene, noe som bekrefter et godt utgangspunkt for videre optimalisering av LC-MS som metode for kvantitative bestemmelser av NSE i human plasma, og som diagnostisk verktøy.