Abstract
Genterapi er ei ny behandlingsform som ventast å kunne brukast ved mange ulike sjukdommar, til dømes autoimmune sjukdommar og kreft. Den vidare utviklinga av genterapi avheng av at ein evnar å utvikle vektorar som kan frakte det genetiske materialet effektivt og spesifikt til målcellene. Vektorane som nyttast kan klassifiserast som virale eller ikkje-virale, i tillegg til at ein nyttar fysiske og fysikalsk-kjemiske metodar for å overføre genetisk materiale, gjerne i kombinasjon med ein vektor. Ikkje-virale vektorar har synt god genoverføringseffektivitet in vitro, men dårlegare effektivitet in vivo. Ein av fordelane med desse vektorane er at ein del av dei kan unngå vertens immunsystem og dermed unngå uheldige immunreaksjonar som kan oppstå ved bruk av virale vektorar. Virale vektorar har til dels god genoverføringseffektivitet in vivo, men dei er ofte lite selektive overfor kva for celler dei infiserer.
For å få målstyring av adenovirale vektorar til kreftceller vart epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) valt som mål sidan denne er oppregulert i ein del kreftceller. Ein annan grunn til å velje EGFR som mål for dei adenovirale vektorane er at denne reseptoren internaliserer bundne ligandar ved endocytose, noko som gjer han høveleg i samband med fotokjemisk internalisering (PCI). PCI er ein metode som baserer seg på at celler inkuberast med fotoaktiverbare sambindingar, fotosensitizerar, som hovudsakleg lokaliserast i endocytiske vesiklar. Lystilførsle til cellene medfører aktivering av fotosensitizeren med påfølgjande oppsprekking av den endocytiske membranen og frigjeving av dei endocyterte makromolekyla til cytosol. Sjølv om adenovirale vektorar har ein mekanisme for å unnsleppe frå endosom er det synt at PCI aukar internaliseringseffektiviteten av desse vektorane. PCI bidreg også til å auke spesifisiteten i behandlinga, sidan selektiv lystilførsle til dei områda ein ynskjer å behandle berre medfører aktivering av fotosensitizeren her.
Føremålet med denne oppgåva var å konjugere ein adenoviral vektor med ein ligand som søkjer seg selektivt til epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR). Dette skulle utførast ved å biotinylere og deretter å konjugere vektoren med fusjonsproteinet streptavidin-epidermal vekstfaktor (ST-EGF), sidan biotin og streptavidin har svært høg affinitet for kvarandre. Vidare skulle både biotinylerte og EGFR-målsøkjande vektorar karakteriserast og bruk av desse vektorane med PCI evaluerast.
Ein metode for å biotinylere dei adenovirale vektorane og seinare konjugering av desse med streptavidin-epidermal vekstfaktor vart etablert. Vellukka biotiylering og ST-EGF-konjugering av biotinylerte vektorar vart verifisert for båe ved Western blott og for dei biotinylerte vektorane i tillegg ved fluorescensmikroskopering. Dessutan vart båe vektorane karakteriserte ved å måle storleik og ladning på dei. Infektiviteten til dei konjugerte vektorane vart testa i DU 145-celler og RD-celler. Av desse celletypane er det berre DU 145-cellene som har adenovirusets normale reseptor, coxsackie- og adenovirusreseptoren (CAR), medan båe har EGFR. Dessutan vart det nytta antistoff og fri ligand for å hemme opptaket av konjugerte vektorar. Generelt synte infeksjonsforsøka lite transduksjon, men dette skuldast at det under oppreinsinga av biotinylerte og konjugerte vektorar var uventa stort svinn. For å få eit betre bilete på det konjugerte adenovirusets selektivitet for EGFR bør infeksjonsforsøka gjentakast med fleire adenovirus per celle. PCI av den målsøkjande adenovirusvektoren synte ein trend til auka reportargenekspresjon med aukande lysdose, men grunna låge transduksjonsnivå bør fleire forsøk utførast før korrekte slutnader kan fattast.