dc.date.accessioned | 2013-03-12T08:52:57Z | |
dc.date.available | 2013-03-12T08:52:57Z | |
dc.date.issued | 2004 | en_US |
dc.date.submitted | 2004-11-01 | en_US |
dc.identifier.citation | Bremer, Sara. IMPDH type I og II ekspresjon i blodceller: Utvikling, validering og etablering av relativ kvantitativ RT-PCR analyse. Hovedoppgave, University of Oslo, 2004 | en_US |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10852/12073 | |
dc.description.abstract | Mykofenolat mofetil (MMF) (CellCept®) brukes etter transplantasjoner for å hindre avstøtning av det transplanterte organet. MMF er et prodrug som raskt omdannes til mykofenolat (MPA). MPA hemmer inosin-5`-monofosfatdehydrogenase (IMPDH) som katalyserer det hastighetsbestemmende trinnet i nysyntesen av guaninnukleotider.
Virkningsmekanismen skyldes trolig hovedsakelig hemmet lymfocyttproliferasjon. Det har ennå ikke blitt etablert et terapeutisk område for plasmakonsentrasjonen av mykofenolat. Til
tross for store inter- og intraindividuelle farmakokinetiske variasjoner, doseres MMF vanligvis i faste doser på 1 gram to ganger daglig.
Analyser av fullblodcellelysat har vist at den basale aktiviteten av IMPDH øker i den første tiden etter transplantasjon hos nyretransplanterte som blir behandlet med MMF. Endringer i
MPA-plasmakonsentrasjonen ble raskt etterfulgt av inverse endringer i IMPDHenzymaktiviteten.Til tross for at den basale enzymaktiviteten, målt rett før MMF dose (C0),økte utover i forløpet, ble den tilnærmet totalt hemmet når plasmakonsentrasjonen av MPA var på topp (Cmax). Det finnes to isoformer av enzymet, IMPDH I og IMPDH II.
Enzymaktivitetsanalysen skiller ikke mellom disse.
Dersom økningen i IMPDH-aktivitet skyldes økt proteinsyntese, vil også mRNA-nivåene for IMPDH I og/eller IMPDH II være økt.
I dette delprosjektet har vi etablert en metode for spesifikk kvantitativ analyse av mRNA for IMPDH I og IMPDH II ved hjelp av relativ sanntids kvantitativ RT-PCR. Denne teknologien
var ikke etablert på laboratoriet der hovedfagsarbeidet er utført, så de ulike metoder og teknologier som er nødvendige ble etablert. Ulike metoder for RNA-stabilisering for analyse av IMPDH-ekspresjon i fullblod ble sammenlignet. Det viste seg at prøveglass som inneholdt
en saltløsning med kationiske detergenter (PAXgene ) egnet seg best for prøvetaking og umiddelbar stabilisering av RNA i fullblodprøver. For isolering av CD4-positive lymfocytter ble det brukt magnetiske kuler med antistoff mot CD4-markøren. RNA fra disse cellene ble
deretter stabilisert ved lysering av cellene med Lysis/binding buffer. Total-RNA ble isolert fra prøvene ved hjelp av MagNA Pure LC . cDNA-syntesen ble gjort i et separat trinn med heksamere primere med tilfeldig (blandet) nukleotidrekkefølge. Deretter ble cDNAtemplatene amplifisert i LightCycler . Dette instrumentet kan detektere amplifikasjonsproduktene underveis i polymerasekjedereaksjonen (PCR), og prosessen benevnes sanntids PCR. Det ble benyttet spesifikke hybridiseringsprober for hvert av genene
til deteksjonen. Kvantifiseringen ble gjort relativt i forhold til ekspresjonen av referansegenene ALAS og G6PDH. Prøvene ble normalisert i forhold til en kalibrator som ble tatt med i hver kjøring. I tillegg ble det benyttet en funksjon i programvaren (LightCycler Relative Quantification) som korrigerer for konsentrasjonsavhengige forskjeller i PCReffektiviteten
for de aktuelle genene.
Metoden ble validert med hensyn til spesifisitet, sensitivitet, deteksjonsgrense, innen-serie og mellom-seriepresisjon og linearitet. Dette ble blant annet gjort ved PCR-analyse av seriefortynninger, gelelektroforese, smeltepunktsanalyse og sekvensering av PCR produkt.
Fire pasienter ble fulgt med gjentatte prøver før transplantasjon og start av MPA-behandling og i inntil to måneder etter. Prøver med lysert fullblod (PAXgene ) ble analysert med den etablerte metoden.
Foreløpige analyser viser at det er store variasjoner i mRNA for IMPDH I etter start av MPAbehandling. Ekspresjonen økte hos tre av fire pasienter. Det var tendenser til reduksjon i
mRNA nivået for IMPDH II.
Analysemetoden kan bidra til å gi økt kunnskap om MPA sin virkning på IMPDH. Dette vil være nyttig i forbindelse med utvikling av en egnet strategi for farmakologisk monitorering og individualisering av MPA-behandling. I tillegg vil det kunne utvide den generelle kunnskapen
om hvordan immunsuppressiva virker. For pasienten vil dette igjen kunne resultere i en behandling med færre bivirkninger og redusert risiko for rejeksjoner. | nor |
dc.language.iso | nob | en_US |
dc.subject | inosinmonofosfat dehydrogenase mRNA reverstranskriptase mykofenolat sanntids PCR LightCycler MagnaPure IMPDH | en_US |
dc.title | IMPDH type I og II ekspresjon i blodceller: Utvikling, validering og etablering av relativ kvantitativ RT-PCR analyse : Ekspresjonsendringer hos nyretransplanterte under mykofenolatbehandling | en_US |
dc.type | Master thesis | en_US |
dc.date.updated | 2005-12-07 | en_US |
dc.creator.author | Bremer, Sara | en_US |
dc.subject.nsi | VDP::568 | en_US |
dc.identifier.bibliographiccitation | info:ofi/fmt:kev:mtx:ctx&ctx_ver=Z39.88-2004&rft_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:dissertation&rft.au=Bremer, Sara&rft.title=IMPDH type I og II ekspresjon i blodceller: Utvikling, validering og etablering av relativ kvantitativ RT-PCR analyse&rft.inst=University of Oslo&rft.date=2004&rft.degree=Hovedoppgave | en_US |
dc.identifier.urn | URN:NBN:no-11409 | en_US |
dc.type.document | Hovedoppgave | en_US |
dc.identifier.duo | 21913 | en_US |
dc.contributor.supervisor | Stein Bergan, Helge Rootwelt, Anders Åsberg, Hege Christensen | en_US |
dc.identifier.bibsys | 042138302 | en_US |