IMPDH type I og II ekspresjon i blodceller: Utvikling, validering og etablering av relativ kvantitativ RT-PCR analyse : Ekspresjonsendringer hos nyretransplanterte under mykofenolatbehandling

Abstract

Mykofenolat mofetil (MMF) (CellCept®) brukes etter transplantasjoner for å hindre avstøtning av det transplanterte organet. MMF er et prodrug som raskt omdannes til mykofenolat (MPA). MPA hemmer inosin-5`-monofosfatdehydrogenase (IMPDH) som katalyserer det hastighetsbestemmende trinnet i nysyntesen av guaninnukleotider. Virkningsmekanismen skyldes trolig hovedsakelig hemmet lymfocyttproliferasjon. Det har ennå ikke blitt etablert et terapeutisk område for plasmakonsentrasjonen av mykofenolat. Til tross for store inter- og intraindividuelle farmakokinetiske variasjoner, doseres MMF vanligvis i faste doser på 1 gram to ganger daglig.

Analyser av fullblodcellelysat har vist at den basale aktiviteten av IMPDH øker i den første tiden etter transplantasjon hos nyretransplanterte som blir behandlet med MMF. Endringer i MPA-plasmakonsentrasjonen ble raskt etterfulgt av inverse endringer i IMPDHenzymaktiviteten.Til tross for at den basale enzymaktiviteten, målt rett før MMF dose (C0),økte utover i forløpet, ble den tilnærmet totalt hemmet når plasmakonsentrasjonen av MPA var på topp (Cmax). Det finnes to isoformer av enzymet, IMPDH I og IMPDH II. Enzymaktivitetsanalysen skiller ikke mellom disse.

Dersom økningen i IMPDH-aktivitet skyldes økt proteinsyntese, vil også mRNA-nivåene for IMPDH I og/eller IMPDH II være økt.

I dette delprosjektet har vi etablert en metode for spesifikk kvantitativ analyse av mRNA for IMPDH I og IMPDH II ved hjelp av relativ sanntids kvantitativ RT-PCR. Denne teknologien var ikke etablert på laboratoriet der hovedfagsarbeidet er utført, så de ulike metoder og teknologier som er nødvendige ble etablert. Ulike metoder for RNA-stabilisering for analyse av IMPDH-ekspresjon i fullblod ble sammenlignet. Det viste seg at prøveglass som inneholdt en saltløsning med kationiske detergenter (PAXgene ) egnet seg best for prøvetaking og umiddelbar stabilisering av RNA i fullblodprøver. For isolering av CD4-positive lymfocytter ble det brukt magnetiske kuler med antistoff mot CD4-markøren. RNA fra disse cellene ble deretter stabilisert ved lysering av cellene med Lysis/binding buffer. Total-RNA ble isolert fra prøvene ved hjelp av MagNA Pure LC . cDNA-syntesen ble gjort i et separat trinn med heksamere primere med tilfeldig (blandet) nukleotidrekkefølge. Deretter ble cDNAtemplatene amplifisert i LightCycler . Dette instrumentet kan detektere amplifikasjonsproduktene underveis i polymerasekjedereaksjonen (PCR), og prosessen benevnes sanntids PCR. Det ble benyttet spesifikke hybridiseringsprober for hvert av genene til deteksjonen. Kvantifiseringen ble gjort relativt i forhold til ekspresjonen av referansegenene ALAS og G6PDH. Prøvene ble normalisert i forhold til en kalibrator som ble tatt med i hver kjøring. I tillegg ble det benyttet en funksjon i programvaren (LightCycler Relative Quantification) som korrigerer for konsentrasjonsavhengige forskjeller i PCReffektiviteten for de aktuelle genene.

Metoden ble validert med hensyn til spesifisitet, sensitivitet, deteksjonsgrense, innen-serie og mellom-seriepresisjon og linearitet. Dette ble blant annet gjort ved PCR-analyse av seriefortynninger, gelelektroforese, smeltepunktsanalyse og sekvensering av PCR produkt.

Fire pasienter ble fulgt med gjentatte prøver før transplantasjon og start av MPA-behandling og i inntil to måneder etter. Prøver med lysert fullblod (PAXgene ) ble analysert med den etablerte metoden. Foreløpige analyser viser at det er store variasjoner i mRNA for IMPDH I etter start av MPAbehandling. Ekspresjonen økte hos tre av fire pasienter. Det var tendenser til reduksjon i mRNA nivået for IMPDH II.

Analysemetoden kan bidra til å gi økt kunnskap om MPA sin virkning på IMPDH. Dette vil være nyttig i forbindelse med utvikling av en egnet strategi for farmakologisk monitorering og individualisering av MPA-behandling. I tillegg vil det kunne utvide den generelle kunnskapen om hvordan immunsuppressiva virker. For pasienten vil dette igjen kunne resultere i en behandling med færre bivirkninger og redusert risiko for rejeksjoner.