| dc.description.abstract | Målet med denne oppgaven var å videreutvikle og optimalisere en LC-MS/MS metode for analyse av blodprøver, inaktivert av etanol, inneholdende den relativt stabile metabolitten av bradykinin; BK 1-5. Metoden baserer seg på Seip og Murphys tidligere arbeid [1, 2], og omfatter prøveopparbeidelse basert på fast-fase ekstraksjon med C18, kromatografisk separasjon med C8 og daughter ion scan utført på en lineær ionefelle. En klinisk studie utføres i samarbeid med Rikshospitalet, hvor pasienter med hereditært angioødem gav blodprøver inneholdende BK 1-5.
Bradykinin ble også implementert i metoden ved fullscan på singelkvadrupol hvor følgende m/z- verdier ble detektert: 354 og 531 m/z. I neste fase ble metoden implementert og optimalisert på en lineær ionefelle. Masseovergangene 287,25 m/z --> 320,16 og 287,25 m/z --> 408,26 m/z (BK 1-5), og 354,30 m/z --> 348,34 m/z (BK) ble valgt. Ved optimaliseringen av metoden ble BK 1-6 brukt som intern standard med følgende masseovergang: 330,80 m/z --> 555,52 m/z. Ved validering av metoden ble en tung form av BK 1-5, BK 1-5 Heavy labelled, implementert i metoden og brukt som intern standard. Følgende masseovergang ble valgt for BK 1-5 H: 292,17 m/z --> 408,26 m/z. Det ble bestemt å bruke BK 1-5 som en indirekte markør på BK- genereringen, og BK ble ikke brukt videre.
Metoden ble fullvalidert, hvor blant annet nøyaktighet, intradag og interdag presisjon, linearitet, og utbytte ble undersøkt. Stabiliteten av BK 1-5 ble undersøkt ved romtemperatur i eluat og etanolisk supernatant, ved analyse i autosampler og ved gjentatte frys og tinsykluser. Metoden viser akseptabel nøyaktighet og presisjon, og gir en god linearitet med r2 verdi > 0,999. LOD ble estimert til 66 pg/mL ut i fra kalibreringskurven og LLOQ satt til 150 pg/mL.
Studien mottok 4 pasienter med HAE-anfall, hvorav to av pasientene også gav kontrollprøve noen uker/måneder etter anfallet. Normalprøver fra 6 friske frivillige ble tatt, og sammenlignet med kontrollprøvene fra HAE-pasientene. Pasientprøvene viste mye høyere BK 1-5 nivåer enn hos de friske frivillige, og ved anfall kunne det ses betydelig høyere nivåer av BK 1-5 generert hos pasientene enn ved kontroll. | nor |