dc.date.accessioned | 2013-03-12T08:49:28Z | |
dc.date.available | 2013-03-12T08:49:28Z | |
dc.date.issued | 2010 | en_US |
dc.date.submitted | 2010-11-19 | en_US |
dc.identifier.citation | Bogen, Kaja Kamilla. Modifisering av energimetabolisme i humane myotuber ved hjelp av galaktose. Masteroppgave, University of Oslo, 2010 | en_US |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10852/11938 | |
dc.description.abstract | Sammendrag
Humane myotuber i kultur har et lavt mitokondrielt oksidativt potensial. Derfor var det ønskelig å forsøke å modifisere cellenes energimetabolisme. Det finnes mange måter å påvirke myotubers energimetabolisme på. En metode er å bytte ut myotubenes energi-substrat. Det var derfor ønskelig å bytte ut glukose i myotubenes dyrkningsmedium med et annet monosakkarid, galaktose, og derved omgå Warburg-effekten. Warburg-effekten er et fenomen, som først ble observert i cancerceller, hvor celler benytter seg av aerob glykolyse istedenfor mitokondriell oksidativ fosforylering (OXPHOS), selv om oksygen er til stede. Galaktose metaboliseres til pyruvat i glykolysen, men gir ingen eller lavere produksjon av adenosintrifosfat (ATP). Cellene blir dermed tvunget til å benytte OXPHOS istedenfor glykolysen til å produsere den energien de trenger for å overleve. I denne masteroppgaven ble galaktose benyttet i cellenes vekstmedium, istedenfor glukose, og vi undersøkte hvordan galaktose påvirket myotubenes energimetabolisme.
Levende bildebehandling av celler dyrket i galaktose viste en signifikant økning i mitokondriell masse og mengde lipiddråper sammenlignet med celler dyrket i glukose. Antall cellekjerner var signifikant redusert hos celler dyrket i galaktose sammenlignet med celler dyrket i glukose.
Det var også av interesse å undersøke om galaktosebehandling medførte endringer på gen-nivå. Real-time PCR viste en nedregulering av myosin tungkjede I (MHC I), myosin tungkjede II (MHC II) og acyl-koenzym A dehydrogenase (MCAD), samt en oppregulering av genene karnitin palmitoyltransferase-1 (CPT1) og cytokrom C (CYC1) for celler dyrket i galaktose sammenlignet med celler dyrket i glukose.
Oljesyre– og glukosemetabolisme hos celler dyrket i galaktose ble også undersøkt ved hjelp av radiomerkede substrater. OA oksidasjonen økte hos celler dyrket i galaktose. Dette stemte overens med den økningen i mRNA-nivå av CPT1 som ble observert i denne oppgaven. Forbehandling av celler med OA under proliferering og differensiering ga ingen tilleggseffekt på oljesyremetabolismen i galaktosebehandlede celler. Oksidasjonen av [U-14C]glukose økte hos celler dyrket i galaktose sammenlignet med celler dyrket i glukose. Forbehandling med oljesyre hos celler dyrket i galaktose økte også glukoseoksidasjon sammenlignet med celler dyrket i glukose (basal).
Suppressibilitet er et begrep som benyttes in vitro for å beskrive i hvilken grad nærvær av glukose undertrykker fettsyreoksidasjon. Celler dyrket i galaktose så ut til å ha en økt suppressibilitet sammenlignet med celler dyrket i glukose. Dette er trolig positivt ved at cellene er mer metabolsk fleksible. Celler dyrket i galaktose så ut til å benytte seg i større grad av glukoseoksidasjon enn fettsyreoksidasjon når totaloksidasjon ble beregnet.
Forbehandling med GW501516 (GW), en PPARδ agonist, i 2 dager så ut til å øke OA oksidasjon for celler dyrket i glukose, men denne effekten ble ikke observert i galaktosebehandlede celler. Fraksjonell OA oksidasjon så ut til å øke i glukosebehandlede celler, men det så ut til å være en redusert oljesyreoksidasjonen hos celler dyrket i galaktose. Glukoseoksidasjonen så ut til å være redusert hos celler dyrket i glukose etter forbehandling med GW, men ingen reduksjon i oksidasjon hos celler dyrket i galaktose.
Myotubenes maksimale oksidasjonskapasitet ble undersøkt ved hjelp av karbonylcyanide p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP) som frikobler elektrontransporten fra ATP-syntesen. Beregning av forskjellen mellom oksidasjon med FCCP til stede og basal oksidasjon tilsvarer reservekapasiteten. Celler som ble dyrket i galaktose så ut til å ha en redusert reservekapasitet for oljesyreoksidasjon etter akutt behandling med FCCP. Celler dyrket i galaktose benyttet seg av omtrent 70 % av maksimal OXPHOS, mens celler dyrket i glukose benyttet omtrent 40 %.
Cellenes reservekapasitet for glukoseoksidasjon økte for celler dyrket i galaktose, også der hvor cellene hadde blitt forbehandlet med oljesyre og GW, i forhold til kontroll. Celler dyrket i galaktose benytter seg av omtrent 60 % av reservekapasiteten for glukoseoksidasjon, og celler dyrket i glukose benytter omtrent 40 %.
I denne oppgaven viser vi at celler dyrket i galaktose blir mer oksidative, har økt mitokondriell masse, og har en økning i mRNA-nivåene av CYC1 og CPT1 sammenlignet med celler dyrket i glukose. | nor |
dc.description.abstract | Summary in english
Cultured human myotubes have a low mitochondrial oxidative potential. Therefore we wanted to remodel energy metabolism in myotubes. Many methods can be used to modify energy metabolism in cells. Replacing the media glucose with galactose is one of these methods and consequently circumventing the Warburg effect. The Warburg effect is a phenomenon, which was first observed in cancer cells, where cells generate energy through aerobic glycolysis instead of mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS), even though oxygen is present. Oxidation of galactose to pyruvat through glycolysis yields no net production of adenosine triphosphate (ATP), forcing cells to rely on mitochondrial OXPHOS to generate sufficient ATP for cell survival. In this study we used galactose in the cells growth and differentiation media, and the effect of galactose on energy metabolism in human myotubes was examined.
Live imaging was performed on cells treated with galactose. The results showed that myotubes treated with galactose had a significant increase in mitochondrial mass and lipid droplets content. The number of cell-nuclei was significantly decreased in cells treated with galactose compared to cells treated with glucose.
We also wanted to examine whether galactose-treatment caused any changes at gene level. Fibertype genes, myosin heavy chain I (MHC I) and myosin heavy chain II (MHC II), and acyl-coenzym A dehydrogenase (MCAD) were down regulated in cells grown in galactose. Carnitin palmitoyltransferase-1 (CPT1) and cytochrome C (CYC1) were up regulated in cells grown in galactose compared to cells grown in glucose.
The effect of galactose on oleic acid (OA) oxidation and glucose oxidation by the cells was examined using labeled substrates. Cells treated with galactose had an increased OA oxidation. This corresponded with an increase in mRNA-level of CPT1 observed in this study. Pretreatment with OA during proliferation and differentiation did not affect fatty acid metabolism in cells treated with galactose. Oxidation of labeled [U-14C]-glucose increased in galactose-treated myotubes. Pretreatment with OA increased glucose oxidation in cells treated with galactose compared to cells treated with glucose.
Suppressibility was also determined and describes suppression of fatty acid oxidation by acute addition of glucose. Myotubes treated with galactose showed an increased suppressibility compared with cells treated with glucose. Increased suppressibility is probably favorable for metabolic flexibility of the myotubes. Cells treated with galactose seemed to utilize oxidation of glucose to a larger extent than fatty acid oxidation when total oxidation was evaluated.
Pretreatment with the PPARδ agonist GW501516 (GW) for 2 days, tended to increased OA oxidation in cells treated with glucose, this effect was not observed in cells treated with galactose. Fractional OA oxidation tended to increase in cells treated with glucose. Cells treated with galactose seemed to slightly decrease fractional fatty acid oxidation. Pretreatment with GW tended to decrease glucose oxidation in cells treated with glucose, whereas cells treated with galactose showed no effect.
The maximal oxidative capacity of human myotubes was examined by acutely adding carbonylcyanide p-trifluormethoxyphenylhydrazone (FCCP) to the cells. FCCP uncouples the respiratory chain in the mitochondria. Calculation of the difference between oxidation in the presence of FCCP and basal oxidation equals the reserve capacity. Acute treatment with FCCP seemed to decrease reserve capacity for fatty acid oxidation in galactose-treated cells. Cells treated with galactose utilized approximately 70 % of maximal OXPHOS capacity, while cells treated with glucose utilized approximately 40 %.
The cells reserve capacity for glucose oxidation was increased in cells treated with galactose, pretreatment with OA and GW also seemed to increase the reserve capacity to oxidize glucose. Myotubes treated with galactose utilized approximately 60 % of maximal OXPHOS capacity, and myotubes treated with glucose utilized approximately 40 %.
In summary we show that cells treated with galactose were more oxidative, had an increased mitochondrial mass, and an increase in mRNA-levels of CYC1 and CPT1. | eng |
dc.language.iso | nob | en_US |
dc.title | Modifisering av energimetabolisme i humane myotuber ved hjelp av galaktose | en_US |
dc.type | Master thesis | en_US |
dc.date.updated | 2011-12-05 | en_US |
dc.creator.author | Bogen, Kaja Kamilla | en_US |
dc.subject.nsi | VDP::568 | en_US |
dc.identifier.bibliographiccitation | info:ofi/fmt:kev:mtx:ctx&ctx_ver=Z39.88-2004&rft_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:dissertation&rft.au=Bogen, Kaja Kamilla&rft.title=Modifisering av energimetabolisme i humane myotuber ved hjelp av galaktose&rft.inst=University of Oslo&rft.date=2010&rft.degree=Masteroppgave | en_US |
dc.identifier.urn | URN:NBN:no-27756 | en_US |
dc.type.document | Masteroppgave | en_US |
dc.identifier.duo | 108275 | en_US |
dc.contributor.supervisor | Professor Arild C. Rustan, professor G. Hege Thoresen, stipendiat Nina P. Hessvik og stipendiat Natasa Nikolic | en_US |
dc.identifier.bibsys | 114927464 | en_US |
dc.identifier.fulltext | Fulltext https://www.duo.uio.no/bitstream/handle/10852/11938/1/Masteroppgave_Bogen.pdf | |