Bestemmelse av Bradykinin 1-5 i fullblod fra gris : Metodeimplementering ved bruk av LC-MS/MS for å bestemme nivået av bradykinin 1-5 i blod fra gris før og etter sepsis

Abstract

Som del av en omfattende dyreeksperimentell studie på Rikshospitalet i Oslo, der ulike intervensjoner blir gjort på griser påført sepsis, ble det sett på bradykinin-eksponeringen og bradykinins betydning i patogenesen. For å oppnå dette har det i denne oppgaven blitt utviklet en LC-MS/MS-metode for bestemmelse av den stabile bradykininmetabolitten BK1-5 (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe) i fullblod, basert på tidligere arbeid av Murphey et al.

En prøveopparbeidelsesteknikk i to trinn er utviklet og tatt i bruk. Den endelige metoden baserer seg på en inaktivering og felling av blod rett etter prøvetakning ved bruk av etanol, og videre opprensning gjennom SPE, med C18 som sorbentmateriale og blandinger av 20 mM HCOOH og MeOH som vaske- og elueringsløsninger.

Analysene ble under metodeutviklingen foretatt med en singelkvadrupol LC-MS, men ble senere overført til en trippelkvadrupol LC-MS/MS, for å få lavere LOQ. En SRM-metode for bestemmelse av BK1-5 gjennom m/z-overgangen 287,00(2+) -> 254,05 (b2) ble utviklet. BK1-6 ble brukt som intern standard. Kromatografien utføres ved hjelp av gradienteluering med 20 mM HCOOH og MeOH i mobilfasene, på en BioBasic C8-kolonne.

Metoden ble testet ut på humane prøver og prøver fra griser inkludert i icatibantstudiet på Rikshospitalet. En partiell validering av metoden ble utført og viste god linearitet (r2>0,999) og akseptabel repeterbarhet (12,8-15,2 %), med en LOQ på 50 pg/mL blod, men med et noe lavt utbytte (19,1-48,2 %) og variabel nøyaktighet (1,2-54,4 %). De biologiske prøvene viste en tydelig økning i signalet for BK1-5 fra før til etter sepsis, noe som ikke er påvist tidligere, fra en udetekterbar mengde (< 50 pg/mL) til en snittkonsentrasjon på 1,62 ± 0,95 ng/mL blod, noe som tyder på at bradykinin blir dannet under patogenesen. Resultatene danner grunnlag for, og viser at implementering av denne metoden kan være svært nyttig i videre forskning på bradykinin og dets metabolitter, og deres betydning i en rekke ulike sykdommer.