ANALYSE AV T-LYMFOCYTTER OG TARMCELLER FOR Å DETEKTERE P-GLYKOPROTEIN

Abstract

Det ble forsøkt å isolere og påvise P-glykoprotein (P-gp) i humane prøver av T-lymfocytter og tarmceller ved å benytte ulike metoder for prøveopparbeidelse. Metodene ble fulgt av fast-fase-ekstraksjon (SPE) med selvlagde C18 SPE-tipper og LTQ Orbitrap LC-MS/MS. Programvaren Proteome Discoverer og søkealgoritmen SEQUEST ble brukt til å identifisere proteiner i prøvene.De forskjellige (prøveopparbeidelses)metodene som ble benyttet var:

•Immunoaffinitetsekstraksjon med in-well proteolyse. Metoden ga som forventet færre proteintreff, i gjennomsnitt ~ 2 treff pr. parallell av T-lymfocyttprøve og ~ 9 treff pr. parallell av tarmprøve, enn direkte in-solution proteolyse med eller uten den overflateaktive forbindelsen SDC.

•Direkte in-solution proteolyse av prøver. Metoden ga i gjennomsnitt ~ 47 proteintreff pr. parallell for T-lymfocyttprøve, og ~11 treff pr. parallell for tarmprøve. Det var treff på både proteiner som finnes i alle eukaryote celler, slik som histoner, og også på proteiner som er mer spesifikke for noen typer celler, slik som plastin-2 i T-lymfocyttprøve og defensin-5 i tarmprøve.

•Bruk av surfaktanten SDC for å ekstrahere/løse P-gp ut av membranen, og in-solution proteolyse. Metoden ga i gjennomsnitt ~ 29 proteintreff pr. parallell av T-lymfocyttprøve. Mange av proteinene var de samme som ble sett etter direkte in-solution proteolyse av T-lymfocytter, som myeloperoxidase, protein S100-A9, protein S100-A8 og talin-1.

•Gelelektroforese med in-gel proteolyse. Selv om P-gp ble påvist på gelen ved hjelp av westernblotting, ble ikke proteinet påvist etter proteolyse og påfølgende LC-MS/MS-analyse.

Gen ontologi (GO) kommentarer (forklaringer) ble funnet for en rekke av proteinene i T-lymfocyttprøve, og de største gruppene av cellulære proteiner som ble identifisert var plasmamembran-, cellekjerne-, kromosomale-, og ekstracellulære proteiner.

Selv om ikke P-gp ble detektert i prøvene etter analyse, viser resultatene med en del proteintreff at proteolyse, LC-MS/MS-analyse og påfølgende identifisering av proteiner ved hjelp av Proteome Discoverer og SEQUEST fungerer for andre proteiner i prøvene.