Bruk av gjær 2-hybrid teknologi i jakten på nye typer antibiotika

Abstract

Bakteriestammer som er resistente mot antibakterielle legemidler er et stadig økende klinisk problem. Klinisk bruk av antibakterielle midler selekterer uunngåelig ut bakterier som huser en resistensmekanisme mot vedkommende middel. Når et nytt antibakterielt legemiddel introduseres, er det derfor bare et spørsmål om tid før en resistent bakteriestamme kan isoleres. Multiresistente patogene bakteriestammer oppstår og en effektiv behandling er da avhengig av at det til enhver tid finnes antibakterielle midler som er introdusert så nylig og brukt så lite at disse stammene ennå ikke har utviklet resistens overfor dem. Det er derfor et konstant behov for nye antibakterielle legemidler og hvis introduksjonen av slike skulle stanse, vil det få svært alvorlige kliniske konsekvenser.

De antibakterielle midlene som er blitt tatt i bruk til nå representerer et svært smalt spekter av virkningsmekanismer. Det er derfor ønskelig å utvikle antibakterielle midler med helt nye virkningsmekanismer og på den måten hindre at introduksjonstakten for nye antibakterielle legemidler blir for lav.

Hemming av interaksjonen mellom DnaA-proteiner er en interessant potensiell ny virkningsmekanisme for antibakterielle legemidler. DnaA er et bakteriespesifikt protein og hemming av dets funksjon kan derfor gi den selektive toksisitet som kreves av et antibakterielt middel. Homooligomerisering av DnaA er nødvendig for initiering av DNA-replikasjon. En kjemisk forbindelse som bryter interaksjonen mellom to DnaA-molekyl vil hemme homooligomeriseringen og dermed initieringen av DNA-replikasjonen og en slik forbindelse vil kunne ha et potensial som antibakterielt middel. Det er nødvendig å utvikle en enkel screening-test for å kunne gjennomsøke store bibliotek av kjemiske forbindelser på jakt etter forbindelser som hemmer interaksjonen mellom to DnaA-molekyler.

Gjær 2-hybrid systemet gjør det mulig å studere protein-protein interaksjoner. En transkripsjonsfaktor, GAL4, har to funksjonelle domener, ett som bindes spesifikt til DNA (BD) og ett som bindes til RNA-polymerase og aktiverer transkripsjonen (AD). Disse to domenene ligger i hver ende av proteinet og mellomstykkets funksjon er å sikre fysisk kontakt mellom de to domenene slik at transkripsjonsfaktoren blir funksjonell. I gjær 2-hybrid systemet finnes ikke et fullstendig GAL4-protein. I stedet introduseres det to nye konstrukter, fusjonsproteinene BD-protein X og AD-protein Y. En interaksjon mellom protein X og protein Y vil bringe BD og AD i fysisk kontakt og dermed gjenopprette en funksjonell transkripsjonsfaktor. Denne transkripsjonsfaktoren aktiverer transkripsjonen av spesielle reportergen i et gjær 2-hybrid system, produktet fra et slik gen gir en fenotypisk endring som lett lar seg monitorere. Slike produkter kan være enzymer i biosynteseveien til essensielle næringsstoffer for gjærcella. En interaksjon mellom protein X og protein Y gir da produksjon av enzymet, gjærcellas biosyntesevei blir komplett, og den produserer det essensielle næringsstoffet. Interaksjonen kan vises makroskopisk ved at gjærcellene vokser på et medium som mangler vedkommende næringsstoff.

DnaA(1-86) betegner en modul med DnaAs aminosyresekvens 1-86 fra aminoterminal ende og DnaA(1-373) betegner en modul med DnaAs aminosyresekvens 1-373 fra aminoterminal ende. I denne oppgaven vises det at DnaA(1-373)-DnaA(1-373) interaksjonen, men ikke DnaA(1-86)-DnaA(1-86) interaksjonen, kan påvises gjennom aktivering av reportergenet his3. Det vil derfor være naturlig å gå videre med modulen DnaA(1-373) ved utviklingen av en screeningtest for kjemiske forbindelser som bryter interaksjonen mellom to DnaA-molekyler.