Toxic effects of nitro-PAHs and amino-PAHs in human bronchial epithelial BEAS-2B cells: role of DNA-damage response.

Abstract

I denne studien har vi evaluert og sammenlignet effektene av ulike nitro-polisykliske aromatiske hydrokarboner (nitro-PAH), som er mutagene og karsinogene forbindelser, og finnes på forurensningspartikler fra blant annet dieseleksos. Humane bronkiale epitelceller (BEAS-2B) ble eksponert for 1-nitropyren (1-NP), 3-nitrofluoranten (3-NF) og 3-nitrobenzantron (3-NBA), og deres korresponderende amino-former, 1-AP, 3-AF og 3-ABA, i tillegg til 2-nitrobenzantron (2-NBA) og benzo[a]pyren (B[a]P). Etter eksaminering med fluorescens mikroskopi viste det seg at 3-NBA var mest cytotoksisk, og at nitro-forbindelsene var mer potente enn sine korresponderende amino-former. Bedømt ut fra nukleær kondensering og kløyving av caspase 3 og PARP, induserte 3-NBA hovedsaklig apoptotisk celledød. Alle forbindelsene, med unntak av 2-NBA og B[a]P, førte til en signifikant økning i frigjøringen av cytokinet CXCL8 (IL-8). Generelt induserte nitro-forbindelsene CXCL8 i større grad enn amino-forbindelsene. Amino-formene derimot gav økt frigjøring av CCL5 (RANTES). B[a]P førte til økt ekspresjon av AhR/ARNT-regulerte gener som CYP1A1/1B1, mens 3-NBA, 3-NF og 1-NP alle reduserte disse genuttrykkene, noe som indikerer AhR/ARNT-antagonisme. 3-NBA forårsaket mest DNA-skade, bedømt ut fra mengden DNA-addukter, DNA enkelttrådbrudd og akkumulering av celler i S-fase. Videre analyse av DNA-skaderesponsen (DDR) viste at 3-NBA aktiverte ATM, Chk2 og p53. Aktiveringen av p53 ble vist ved økt fosforylering og translokasjon til kjernen. 2-NBA, 1-NP og B[a]P førte ikke til fosforylering av disse proteinene. p53-hemmeren, pifithrin-α, reduserte mengden 3-NBA-indusert celledød, hvilket tyder på at DNA-skade/DDR-signalisering og aktivering av p53 er sentrale komponenter i slik celledød. Studien illustrerer at de ulike PAH har svært forskjellige toksiske potensialer (målt i celledød og cytokindannelse), og små endringer i molekylstruktur, så som plassering av nitro-grupper eller substitusjon av nitro- med en aminogruppe, har dramatisk innvirkning på toksisiteten.

In the present study we have examined and compared the effects of some chemically related nitro-polycyclic aromatic hydrocarbons (nitro-PAHs), which are mutagenic and carcinogenic environmental pollutants, found in diesel exhaust and urban air pollution particles. Human bronchial epithelial cells (BEAS-2B) were exposed to 1-nitropyrene (1-NP), 3-nitrofluoranthene (3-NF) and 3-nitrobenzanthrone (3-NBA), and their corresponding amino forms, 1-AP, 3-AF and 3-ABA; in addition 2-nitrobenzanthrone (2-NBA) and benzo[a]pyrene (B[a]P) were included in this work. Examination by microscopy revealed that 3-NBA was the most cytotoxic, and that the nitro compounds were more potent than their corresponding amino compounds. Judged by nuclear condensation, and cleavage of caspase 3 and PARP, 3-NBA induced mainly apoptotic cell death. All the test compounds, except 2-NBA and B[a]P, significantly increased the release of the cytokine CXCL8 (IL-8), and the highest levels were induced by 1-NP and 3-NF. In addition, the corresponding amino forms, 1-AP and 3-AF, induced increased release of CCL5 (RANTES). B[a]P induced increased CYP1A1/1B1 gene expression, while 3-NBA, 3-NF and 1-NP all reduced CYP1A1/1B1 expression, suggesting AhR/ARNT antagonism. 3-NBA caused the most DNA damage, judged by the amount of DNA adducts and DNA single-strand breaks (SSBs), giving an explanation for the observed accumulation of cells in S-phase. Further analysis of the DNA damage response (DDR) showed that 3-NBA activated ATM and Chk2. p53 was found to be activated by phosphorylation and translocation to the nucleus. The p53 inhibitor, pifithrin-α, inhibited the 3-NBA-induced apoptosis, suggesting that the cell death was a result of triggering of DDR signalling pathways, ending up with an activation of p53. In conclusion, the different PAHs had very different toxic potentials (cell death and cytokines), and small changes in the molecular structures, such as a change of the nitro-group from position 3 to 2 or a substitution of a nitro- with an amino-group, had dramatic effects.