Abstract
Sammendrag
Unge menn fra Norge har lavere sædkvalitet og høyere forekomst av testikkelkreft enn for eksempel menn fra Finland. Disse funnene kan være et resultat av endringer i livsstil, kosthold eller miljø. Lavere sædkvalitet og testikkelkreft vil kunne gi redusert fertilitet. Akrylamid er et stoff som ikke forekommer naturlig, men produseres industrielt. Da det ble vist at akrylamid dannes under oppvarming av stivelsesholdige matvarer, ble det nødvendig med nye vurderinger av mulige toksikologiske effekter av stoffet. Akrylamid og/eller metabolitten glysidamid er funnet å være nevrotoksisk, reproduksjonstoksisk og karsinogen i dyremodeller. I mennesker er akrylamid vist å være nevrotoksisk. Nyere epidemiologiske undersøkelser har også funnet signifikante sammenhenger mellom inntak av akrylamid og ulike krefttyper i mennesker.
I denne oppgaven ble akrylamids evne til å indusere DNA-skader i kjerner fra testikkel, lever, nyre og lymfocytter undersøkt i kometsystemet. Det ble benyttet en musemodell (Ogg1-/-) som mangler reparasjonsenzymet mOGG1. Siden det er vist lav aktivitet av OGG1 i humane testikkelceller antar man at Ogg1-/- mus vil være en relevant modell for å studere mannlige reproduksjonstoksiske effekter hos mennesker. Ved bruk av DNA-glykosylasen fpg i kometmetoden ble det vist at akrylamid dannet DNA-skader i de undersøkte vevene. Fpg har bred substratspesifisitet og detekterer visse typer alkyleringsskader og oksidative skader. I Ogg1+/+ mus ble det høyeste skadenivået detektert åtte timer etter eksponering for 50 mg AA/kg kroppsvekt. Sju dager etter eksponering var DNA-skadenivået redusert ned til bakgrunnsnivået. Dette er en indikasjon på at de akrylamidinduserte skadene kan repareres i denne genotypen. Tilsvarende reduksjon av DNA-skader i Ogg1-/- mus ble ikke observert. I denne muselinjen ble det høyeste skadenivået målt fire timer etter eksponering for 25 mg AA/kg kroppsvekt. Disse resultatene indikerer at OGG1-enzymet er delvis involvert i reparasjon av akrylamidinduserte DNA-skader. I begge musetypene ble det observert høyere skadenivåer i kjerner fra somatiske vev sammenlignet med testikkelkjerner. Dette kan tyde på at effektene av akrylamid på DNA ikke er hovedmekanismen bak tidligere observerte reproduksjonstoksiske effekter.
Genuttrykket av to gener involvert i metabolisme av akrylamid ble undersøkt med sanntids-PCR. GSTM1 er en av flere glutationtransferaser som er viktig for detoksifisering av akrylamid, mens CYP2E1 epoksiderer akrylamid, slik at det dannes glysidamid. Det ble ikke observert endringer i uttrykket av mGstm1 i verken testikkel eller lever, to timer, 24 timer eller sju dager etter eksponering. Uttrykket av mCyp2e1 ble heller ikke endret i lever. Resultatene viste heller ingen forskjeller mellom de to undersøkte genene i de to muselinjene. De ulike akrylamideffektene skyldes derfor ikke ulik uttrykk av mGstm1 eller mCyp2e1 i de to muselinjene, men heller om enzymet OGG1 er tilisede eller ikke.
Abstract
Young Norwegian men have lower semen quality and a higher incidence of testicular cancer than men from Finland. These observations can be due to changes and differences in lifestyle, diet or environmental factors. Low semen quality and testicular cancer can lead to reduced fertility. Acrylamide is produced industrially and does not occur naturally in the environment. Recently acrylamide was discovered to be formed during heating of starch-rich foods. This finding made further investigations necessary to evaluate toxic effects of acrylamide in humans. Acrylamide and/or the metabolite glycidamide have previously been shown to be neurotoxic, to have reprotoxic effects and to be carcinogenic in animal models. Acrylamide is found to be a neurotoxicant in humans. In recent epidemiologic studies, significant associations between dietary intake of acrylamide and different types of cancer in humans have been found.
In this study, the ability of acrylamide to induce DNA damage in nuclei from testis, liver, kidney and from lymphocytes was examined, using the comet assay. A mouse model (Ogg1-/-), deficient in the DNA repair enzyme mOGG1 was used. The same enzyme (hOGG1) has low activity in human testicular cells, and these Ogg1-/- mice are therefore considered to be a relevant model for evaluation of effects on the male reproductive organ in humans. Fpg, a DNA glycosylase, was included in the comet assay and the analysis showed that acrylamide induced DNA damage in the four examined tissues. Fpg is an enzyme with broad substrate specificity, detecting certain alkylation and oxidative damages in DNA. The highest levels of DNA damage in Ogg1+/+ mice were measured eight hours after exposure to 50 mg AA/kg body weight. The detected DNA damage was reduced to background levels seven days after exposure, indicating that the acrylamide induced DNA damage can be repaired in mice of this genotype. An incomplete repair of DNA damages was observed in Ogg1-/- mice. The highest levels of DNA damage in these mice were measured four hours after an acrylamide exposure to 25 mg AA/kg body weight. These results indicate that the OGG1 enzyme is partly involved in the repair of acrylamide induced DNA lesions. In both mouse strains, higher levels of DNA damage were observed in somatic nuclei compared to testicular nuclei, indicating that effects on DNA may not be the main mechanism behind the previously observed reprotoxic effects of acrylamide.
The gene expression of two genes involved in the metabolism of acrylamide was evaluated using real-time PCR. GSTM1 is one of several glutathione s-transferases important for detoxification of acrylamide. Epoxidation of acrylamide by CYP2E1 generates the metabolite glycidamide. No change in the expression of mGstm1 was observed in the testis or the liver 2 hours, 24 hours or 7 days after acrylamide exposure. The expression of mCyp2e1 in the liver was also found to be unchanged. Similar expression of the examined genes were observed in both mice strains with different genotypes, strengthening that the observed differences in DNA-damage in Ogg1+/+ and Ogg1-/- mice is not a result of different expression of the acrylamide relevant metabolism genes mGstm1 or mCyp2e1 but rather the presence or absence of the mOgg1 enzyme.