Enniatin B induced inflammatory response and cell death in RAW 264.7 murine macrophages

Abstract

Dette studiet er gjort for å undersøke cytotoksiske og inflammatoriske effekter av mykotoksinet, enniatin B (EnnB) på makrofager av museopphav (RAW 264.7 celler). EnnB produseres av forskjellige stammer av muggsoppen Fusarium og finnes som en hyppig forekommende kontaminant i kornblandinger som benyttes til mat for mennesker og dyr. For dette studiet er EnnB produsert fra F. avenaceum-kulturer benyttet. De cytotoksiske egenskapene til EnnB skyldes mest trolig evnen til å danne porer for transport av kationer i biologiske lipidmembraner. Undersøkelser er gjort i forhold til karakterisering av celledød, påvirkning av celleproliferasjon og produksjon av cytokiner (betennelsesmarkører) utløst av ulike nivåer mykotoksin.

Resultatene viser at EnnB eksponering fører til en opphopning eller arrest av celler i G1-fasen av cellesyklus, dette ble undersøkt ved bruk av flow cytometri og ved analyse av cellesyklusrelaterte proteiner ved Western blotting. Bruk av fluorescence mikroskop viste at celler eksponert for EnnB får morfologiske trekk assosiert med apoptose, i tillegg ble skader på lysosomene observert ved bruk av elektron mikroskop. Videre vises en oppregulering av aktivert caspase-1 og i celler preinkubert med lipopolysakkarid (LPS) etterfulg av EnnB eksponering ble det målt høye verdier av interleukin-1 beta (IL-1β) ved bruk av ELISA. Ved å benytte en caspase-1 spesifikk hemmer ble denne utskillelsen av cytokiner redusert. På bakgrunn av disse resultatene antar vi at EnnB fører til en aktivering av et proteinkompleks, inflammasomet, etterfulgt av caspase-1 aktivering og utskillelse av IL-1β.

The mycotoxin enniatin B (EnnB) is predominantly produced by species of the Fusarium genera, and is one of the emerging Fusarium mycotoxins reported to be found at high concentrations in Norwegian grain. The cytotoxic effect of EnnB is thought to be caused by the ability to form ionophores in cellular lipid membranes. In the present study, RAW 264.7 macrophages of mouse origin were exposed to EnnB followed by the use of different assays in order to characterize the effect on cell death, cell proliferation, differentiation and potential inflammatory response. Exposure to EnnB arrested the cells in the G1-phase of the cell cycle after 24 hr exposure, and induced morphological features related to apoptosis in cells examined by fluorescence microscope. Damaged lyosomes were also observed on micrographs. Elevated levels of activated caspase-1 were observed after exposure, and cells primed with lipopolysaccharide (LPS) in addition to EnnB secreted significantly higher levels of interleukin-1 beta (IL-1β), compared to the controls. Treatment with the caspase-1 specific inhibitor, ZYVAD-FMK, prior to exposure with both LPS and EnnB inhibited this cytokine release. Activation of the inflammasome, followed by cleavage of caspase-1 and processing and release of IL-1β is proposed as a mechanism of action for EnnB.