Abstract
SAMMENDRAG
Celler er kontinuerlig utsatt for påvirkninger som kan skade dets DNA. Dette inkluderer oksidative DNA-skader, som oppstår via normal oksidativ metabolisme, og fra forbindelser i miljøet. Slike DNA-skader kan forårsake mutasjoner. Cellene har imidlertid ervervet mekanismer for å reparere DNA-skader for å opprettholde arvematerialets integritet. En viktig mekanisme for å reparere oksidative DNA-skader er baseutkuttingsreparasjon (BER).
Arvematerialets integritet i testikkelceller er svært viktig da disse cellene bærer informasjonen nødvendig for videre generasjoner. Tidligere har avdelingen som denne hovedoppgaven er utført ved vist klare forskjeller i evnen til å reparere visse typer oksidative DNA-skader i testikkelceller mellom mennesker og gnagere. I motsetning til rotte og mus har menneskets testikkelceller liten eller ingen evne til å reparere oksiderte puriner. Gnagere er derfor muligens ikke ideell som modell for studier av oksiderende kjemikaliers virkninger på mannens kjønnsceller. I denne oppgaven har vi derfor valgt å undersøke en transgen muselinje med defekt 8-oksoguanin-DNA glykosylase-1 (Ogg1), et sentralt enzym i reparasjonen av de nevnte oksiderte puriner.
Målene med oppgaven var å undersøke om denne muselinjen har bedre potensiale som modell enn villtype mus når det gjelder oksidativ DNA-skade og reparasjon i testikkelceller. Først ble en allerede eksisterende metode (kometmetoden), som benyttes til å undersøke induksjon og reparasjon av oksidative skader, forbedret og forenklet. I denne metoden kan oksiderte puriner kvantifiseres ved bruk av det bakterielle enzymet Fpg. Oksiderte puriner ble indusert i testikkelceller fra mus av ulik genotype (Ogg1(+/+), Ogg1(+/-) og Ogg1(-/-)) ved bruk av en fotoaktiv forbindelse, Ro 12-9786 sammen med synlig lys. Denne behandlingsform gir overvekt av 8-okso-7,8-dihydroguanin (8-oxoG)-skader i motsetning til mange andre behandlingsformer. I del to av oppgaven ble ekspresjon av enzymer for metabolsk aktivering, samt enzymer som deltar i reparasjon av oksidative DNA-skader, undersøkt ved westernanalyser i mus av ulik genotype eksponert for benzo(a)pyren (BaP).
Den videreutviklede kometmetoden ga mulighet for 3 ganger flere prøver per eksperiment og 5 ganger lavere antall celler nødvendig per prøve, samt vesentlig enklere og raskere utførelse. Som forventet ble det ikke observert reparasjon av Fpg-sensitive DNA-skader i løpet av 4 timer i testikkelceller fra Ogg1-defekte mus 8-oxoG med kometmetoden, mens reparasjon i villtype og heterozygote mus var svært effektiv. Videre var det spontane nivået av Fpg-sensitive DNA-skader 15 ganger høyere i testikkelceller fra Ogg1-defekte mus, og nivået var omtrent likt i menneske, sammenlignet med Ogg1(+/+) og Ogg1(+/-)-mus. Ekspresjonsanalysene viste at de mest sentrale proteinene for metabolisme og bioaktivering av BaP var til stede i testikkel fra mus. Cyp1a1 ble indusert i testikkel og lever etter BaP-eksponering, mens Cyp1a2 ble indusert kun i lever. Dette antyder at Ogg1-defekte mus har lik respons overfor BaP som villtype mus. Resultatene våre tyder så langt på at Ogg1(-/-) musene kan være en god modell for kjemikalietesting i testikkelceller.