| dc.description.abstract | Bakteriosiner er ribosomalt syntetiserte, antimikrobielle peptider som produseres av en rekke bakteriearter. Lactococcin G er et bakteriosin som består av to peptider, kalt α og β, og produseres av melkesyrebakterien Lactococcus lactis LMG 2081. For at bakteriosinproduserende celler ikke skal bli drept av sitt eget bakteriosin, produserer de et immunitetsprotein sammen med bakteriosinet. Lite er kjent om hvordan beskyttelsesmekanismen fungerer, og for å få mer kunnskap om hvordan immunitetsproteinene utøver sin aktivitet på et molekylært nivå, er det nødvendig å kjenne strukturen til proteinene. Så langt har ingen tredimensjonale strukturer til immunitetsproteiner for to-peptidbakteriosiner blitt publisert. For å analysere den tredimensjonale strukturen til et protein ved røntgenkrystallografi og/eller nukleær magnetisk resonans (NMR), må det være rent og produseres under betingelser som muliggjør isotopmerking med 15N og/eller 13C (for NMR), og i mengder som tillater 3D-strukturbestemmelse ved røntgenkrystallografi eller NMR.
For å oppnå dette har det blitt konstruert plasmider for heterolog ekspresjon av immunitetsproteinet til lactococcin G (lcnG-im). Genet som koder for lcnG-im, lagC, ble klonet i ekspresjonsvektorene pET 30b og pET SUMO under kontroll av en T7lac promotor. De resulterende plasmidene pET30b-lagC og pET SUMO-lagC ble transformert inn i tre ulike E. coli-stammer for proteinekspresjon. Dette var BL21 (DE3), BL21-CodonPlus (DE3)-RIL og Rosetta 2 (DE3). De to sistnevnte inneholder et plasmid med ekstra tRNA-gener for translasjon av kodoner som er sjeldent brukt i E. coli. Fra pET 30b-lagC ble lcnG-im uttrykt med en C-terminal 6 x histidin (his-tag), og fra pET SUMO-lagC ble lcnG-im uttrykt med en N-terminal his-tag etterfulgt av et SUMO fusjonsprotein. Produksjon av lcnG-im ble bare påvist i Rosetta 2 (DE3), men mengden protein var svært lav. For å påvise proteinet var det nødvendig å bruke Western blotting, med anti-his antistoff som binder seg til 6 x histidin som var lagt til lcnG-im på enten C- eller N-terminal ende. Resultatene tyder på at lcnG-im var toksisk for E. coli, da de fleste proteinproduserende celler døde kort tid etter induksjon. Celledøden gikk raskere for celler som inneholdt plasmidet pET 30b-lagC, enn for celler som inneholdt plasmidet pET SUMO-lagC.
Da lcnG-im ble uttrykt på et lavt nivå med E. coli som ekspresjonssvert, ble det forsøkt å uttrykke lcnG-im i P. pastoris. Det ble konstruert et plasmid, pPICZαB-lagC, som ble
inkorporert i genomet til P. pastoris ved homolog rekombinasjon. Ved å bruke vektoren pPICZαB, vil lcnG-im uttrykkes med et N-terminalt sekresjonssignal, som muliggjør sekresjon av det rekombinante proteinet ut av cellen. pPICZαB har en markør for zeocin-resistens, og kan replikeres og opprettholdes i E. coli, men ikke i P. pastoris. Produksjon av zeocin-resistente P. pastoris-transformanter tyder derfor på at det hadde skjedd en rekombinasjon mellom plasmidet og genomet. På tross av dette lyktes det ikke å påvise proteinet, og det vil være nødvendig med mer arbeid med P. pastoris som ekspresjonssvert. | nor |