| dc.description.abstract | Prionsykdommer er en gruppe nevrodegenerative, dødelige sykdommer som
forekommer hos både dyr og mennesker, og forårsakes av en
konformasjonsendring i det endogene prionproteinet (PrP). I normal hjerne og i flere
andre vev, samt i cellekultur, utsettes en andel av PrP en proteolytisk kløyving som
en del av sin normale prosessering. Kløyvingen for PrP fra sau skjer rundt
aminosyre 113, og gir to kløyvingsprodukter når proteinet uttrykkes i N2a- og MDCK
II-celler. Denne kløyvingen av PrP er antatt å skje et sted i den sekretoriske veien,
på vei ut til PM, eller etter endocytose. Tidligere arbeid i forskningsgruppa har gått
ut på å stoppe kløyvingen ved å mutere rundt kuttesetet, men foruten at fjerningen
av aminosyre 105-115 eller 105-125 førte til at det største kløyvingsproduktet
forsvant, har det ikke vært mulig å stoppe prosesseringen av PrP (Tveit et al.,
2005b). I denne oppgaven ble innvirkningen det C-terminale doménet til PrP fusert
med grønt fluorescerende protein (GFP) har på proteinets interne proteolytiske
kløyving undersøkt. Forskjellige konstrukter ble laget, der den C-terminale delen av
PrP-GFP ble mutert eller fjernet, og disse ble uttrykt i MDCK II- og N2a-celler.
Forandringer i det C-terminale doménet hadde en viss innvirkning på
prosesseringen, men kløyvingen lot seg ikke stoppe. Det ble derfor laget noen
cytoplasmatiske varianter av PrP-GFP som ikke skal kunne translokeres inn i den
sekretoriske vei, og dermed heller ikke kløyves. Da også cytoplasmatisk PrP-GFP
ble kløyvet, kan det se ut til at prosessering av PrP-GFP kan skje både i den
sekretoriske veien og i cytoplasma. Det ble derfor undersøkt om kløyvingen hadde
en sammenheng med feilfolding og ER-assistert degradering. Det så imidlertid ut til
at proteasomene i liten grad deltok i prosesseringen av PrP-GFP.
PrP-GFPs prosessering langs den sekretoriske vei ble undersøkt videre, og
subcellulær fraksjonering viste at PrP-GFP i Golgi-apparatet i liten grad var
proteolytisk prosessert. Ved å redusere transporten av proteiner fra Golgi-apparatet
til PM ved hjelp av brefeldin A-behandling, ble det observert en økt mengde av ikkeprosesserte
PrP-GFP-varianter. Proteiner som skal til PM forlater Golgi-apparatet i
vesikler som ved hjelp av protonpumper blir surere jo nærmere PM de kommer. Baf
A1-behandling som nøytralisere vesiklene ved å hemme protonpumpene resulterte i
en økning i mengde fullengde protein, noe som tyder på at prosesseringen påvirkes
av pH, og kan skje i vesikler nær PM.
Det ble undersøkt i hvilken grad det C-terminale doménet til PrP-GFP påvirket
polarisert transport i MDCK-celler, og i hvilken grad endring i pH og hemming av
sekretorisk transport påvirket den polariserte utskillelsen. Det viste seg at
sheddede og sekretoriske PrP-GFP-varianter ble sortert apikalt i MDCK II-celler,
og det som ble utskilt ut var hovedsakelig den N-terminale prosesserte formen av
proteinet.
Andre har vist at PrP fra sau har et annet kløyvingsmønster enn det som er vist i
denne oppgaven, men da befinner PrP seg for det meste på plasmamembranen
(Bragason and Palsdottir, 2005). PrP i denne oppgaven var også til en viss grad
lokalisert til membranen, men var hovedsakelig spredd utover i cella. Det som skiller
PrP i Bragasons eksperimenter fra PrP i denne oppgaven, er noen endrede
aminosyrer og bruk av en annen ekspresjonsvektor. PrP genet ble derfor flyttet over
i den aktuelle ekspresjonsvektor og begge PrP-konstruktene ble uttrykt for
sammenligningens del. En helt annen lokalisering ble registrert med den nye
vektoren, og det var mye mindre kløyvingsprodukt. | nor |