Karakterisering av transkripsjonsfaktoren B-Myb sin optimale DNA-bindingssekvens

Abstract

1 SAMMENDRAG

En transkripsjonsfaktor er et protein som er involvert i reguleringen av RNA polymerasens transkripsjonsaktivitet. Et aspekt av reguleringen er at en del av disse faktorene har evnen å binde spesifikke DNA sekvenser. Da en slik spesifikk sekvens ikke nødvendigvis finnes i alle gener innebærer sekvensspesifikk binding at et protein regulerer kun spesifikke gener.

Myb transkripsjonsfaktorer er eksempler på proteiner med sekvensspesifikk binding til DNA. I vertebrater består denne familien av tre medlemmer, A-, B og c-Myb. Alle disse medlemmene har betydning for differensiering og celleproliferasjon. Allikevel er det forskjeller i deres biologiske effekter. Det er også forskjeller i uttrykksmønsteret til disse tre genene. For å forstå ulikhetene til disse to proteinene fra en molekylær synsvinkel har man flere angrepsmåter. En måte å løse problemet på kan være å se nærmere DNA-binding. En optimal DNA-bindingssekvens er bestemt for c-Myb ved hjelp av in vitro seleksjonsmetoder fra randomiserte DNA-bibliotek. B-Myb har vist seg å ha DNA-bindingsegenskaper som avviker fra c-Mybs DNA-bindingsegenskaper. En hypotese har vært om B-Myb har en sekvensspesifisitet som avviker fra c-Mybs sekvensspesifisitet. Min problemstilling har derfor vært å bestemme en optimal konsensus DNA-bindingssekvens for B-Myb ved hjelp av in vitro seleksjonsmetoder. Med en slik sekvens vil det bli lettere å identifisere ulike målgener for c- og B-Myb og derigjennom kunne forklare c- og B-Mybs biologiske aktivitet fra en biokjemisk synsvinkel.

Jeg gjorde et forsøk på å etablere en in vitro seleksjonmetode med bruk av et randomisert DNA-bibliotek for B-Myb. Dette førte ikke frem. Deretter fulgte jeg en allerede etablert protokoll for in vitro seleksjon av optimale bindingssekvenser, men fikk underveis problemer med bindingsaktiviteten til proteinet. Jeg avsluttet med EMSA studier på B-Myb med ulike varianter av c-Mybs optimale DNA-bindingssekvens. På bakgrunn av disse resultatene kunne jeg si noe om hvilke basepar B-Myb foretrakk i spesifikke posisjoner og også sammenholde disse resultatene med tilsvarende studier utført på c-Myb. Dermed var det mulig å uttale seg om disse to proteinene har ulik sekvensspesifikk DNA-bindingsaktivitet.