Konstrukter for ekspresjon av WWOX i mammalske celler

Abstract

Det humane genet WWOX har blitt identifisert av flere uavhengige forskningsgrupper i forbindelse med studier av strukturelle abnormaliteter på kromosom 16q i ulike krefttyper. Genet er lokalisert innenfor kromosom 16q23.3-24.1, et område hvor det er observert høy frekvens av tap av heterozygositet (LOH) i en rekke tumorer og tumorcellelinjer. Det er observert endret WWOX-ekspresjon i flere krefttyper, inkludert karsinomer av bryst, prostata, luftrør, lunge, bukspyttkjertel og mage. I flere tumorer og tumorcellelinjer av ulik opprinnelse, hvor nivået av fullengde WWOX-transkript er svært lavt, er det blitt påvist uttrykk av kortere, ufullstendige WWOX-transkripter. Flere observasjoner har indikert at WWOX-proteinet fungerer som en tumorsuppressor, og WWOX har blitt vist å interagere med p53 homologen p73.

Stabil opprettholdelse av store innskudd i bakterielle og P1 deriverte kunstige kromosomer (BACer og PACer), gjør at disse er svært hyppig brukt i studier av mammalske gener. Introduksjon og ekstrakromosomal opprettholdelse av PAC/BAC i mammalske celler krever ikke integrering i vertsgenomet. Dette reduserer risikoen for mutasjoner ved integrering.

Denne oppgaven gikk ut på å konstruere et fullengde WWOX-cDNA-konstrukt med 6,4 kb av det native WWOX-oppstrømsområdet som promoter. Dette ble satt inn i PAC-vektoren pPAC6 for å muliggjøre ekstrakromosomal opprettholdelse i mammalske celler. Deretter ble konstruktet transfektert inn den humane brysttumorcellelinjen SK-BR-3 hvor fullengde WWOX ikke ble detektert i en tidligere studie.