Abstract
c-Myb er en transkripsjonsfaktor som er involvert i proliferasjon, differensiering og apoptose, hovedsakelig av hematopoetiske celler. Den transkripsjonelle aktiviteten av c-Myb har vist seg å være avhengig av forskjellige posttranslasjonelle modifkasjoner.
”Small ubiquitin-like modifiers” (SUMO) er en familie av proteiner som de seneste årene er blitt viet mye forskning. SUMO proteinene har det til felles med ubiquitin at de kan konjugeres til andre proteiner posttranslasjonelt, og en rekke forskjellige transkripsjonsfaktorer har vist seg å bli sumoylert. SUMO er tidligere vist å konjugeres til c-Myb på 2 forskjellige lysin residuer og mutasjon av disse konjugeringssetene (c-Myb-2KR) er vist å føre til at den transkripsjonelle aktiviteten til c-Myb øker.
En utfordring man står overfor når man vil studere hvilken effekt SUMO-konjugering av c-Myb har på c-Myb avhengig transkripsjon, er at sumoylering er en reversibel prosess og bare en liten andel av en transkripsjonsfaktor i en celle vil til enhver tid være sumoylert. Det er enkelt via mutanter å skape en ikke-sumyolert faktor, men mindre opplagt hvordan man kan studere egenskapene til en fullt og alltid sumoylert form. I dette prosjektet er det nettopp det siste vi har prøvd å få til, for dermed sikrere å kunne studere effekten som sumoylering av c-Myb har på faktorens transkripsjonelle egenskaper når den foreligger i konjugert form.
Vi valgte i en strategi hvor vi lagde fusjoner mellom c-Myb og SUMO som ikke kunne brytes av SUMO-proteaser for deretter å prøve å studere hvilken effekt SUMO-konjugering har på c-Mybs transkripsjonelle aktivitet. Det ble også benyttet immunofluorescense og konfokalmikroskopi for å studere om den subcellulære lokalisasjonen til c-Myb ble forandret når c-Myb var sumoylert sammenliknet med fritt c-Myb.
Det viste seg ved å benytte reporteraktiveringsassay at aktiviteten til c-Myb-2KR-SUMO fusjonskonstruktene var markant lavere enn c-Myb-2KR og at SUMO-konjugering av c-Myb derfor fører til en reduksjon i c-Mybs transkripsjonelle aktivitet.
Ved å sammenlikne våre fusjonsproteiner med c-Myb proteiner som mangler det negative regulatoriske domenet (NRD) ønsket vi videre å se om SUMO-konjugering av c-Myb kan forklare NRDs negative regulatoriske effekt på c-Mybs transkripsjonelle aktivitet. Effekten av å fjerne NRD (c-Myb-[1-443]) ble i stor grad oppveiet ved en SUMO fusjon (c-Myb-[1-443]-SUMO), men vi kan likevel ikke utelukke at det er andre aktiviteter knyttet til NRD som ikke fanges opp av vårt reporteraktiveringsassay.
Ved hjelp av immunofluorescense og konfokalmikroskopi undersøkte vi om den subcellulære lokalisasjonen til c-Myb ble forandret ved SUMO-konjugering. Vi fant ikke bevis for at den subcellulære lokalisasjonen til c-Myb forandres ved SUMO-konjugering, tvert imot ser den subcellulære lokalisasjon til c-Myb å være uforandret ved SUMO-konjugering sammenliknet med fritt c-Myb. Det kan se ut til at andre faktorer er viktigere for c-Mybs lokalisasjon enn SUMO siden c-Mybs lokalisasjon forandres fra celle til celle.