siRNA som verktøy til transient nedregulering av spesifikke gener

Abstract

NUCKS-proteinet ble oppdaget i 1985 av Anne Carine Østvold og hennes medarbeidere ved Biokjemisk Institutt, Universitetet i Oslo. NUCKS genet er klonet og proteinet nøye karakterisert, men dets biologiske funksjon er fremdeles ukjent. RNA interferens (RNAi) er en metode for å indusere sekvensspesifik nøytralisering av et eller flere gener av interesse. I denne metoden introduserer man små interfererende RNA molekyler (siRNA) til celler i kultur. Praktisk betyr dette at man transfekterer celler med korte dobbeltrådede RNA-molekyler som er komplementære til gensekvensen man vil slokke ut. Man kan deretter undersøke fenotypen til de transfekterte cellene som reflekterer utslokkingen av funksjonen til det korresponderende genet. I denne oppgaven skulle det undersøkes hvorvidt to designede siRNA molekyler ga utslokking av NUCKS genet ved hjelp av co-transfeksjonsforsøk og Western immunoblot. Man skulle også vurdere hvilke av flere mulige transfeksjonsmidler som ga minst toksisk effekt vurdert ut fra trypanblå farging og mikroskopering. Resultatene viste at alle transfeksjonsmidlene hadde lik transfeksjonseffektivitet med hensyn til transfeksjon med siRNA. Lipofectamine 2000 var det mest effektive transfeksjonsmiddelet når man skulle transfektere med lange DNA molekyler (plasmid DNA), men var samtidig det mest toksiske transfeksjonsmiddelet. For våre studier med NUCKS siRNA kom vi frem til at RNAiFect er det beste transfeksjons reagenset, idet dette var lite toksisk og ga god utslukking.