Lokalisering av glutamatransportøren EAAC i hippocampus CA1

Abstract

Glutamat er kvantitativt den dominerende eksitatoriske nevrotransmitteren i sentralnervesystemet (CNS) hos pattedyr, og er sannsynligvis involvert i de fleste aspekter ved normal hjernefunksjon, inkludert hukommelse og læring. Hjernen inneholder store mengder glutamat, men på tross av det og at glutamat hele tiden frisettes, befinner nesten all glutamat seg intracellulært. Dette skyldes at ekstracellulær glutamat raskt blir pumpet inn i cellene ved hjelp av glutamattransportører. Fem subtyper av disse transportørene er til nå blitt identifisert (GLAST, GLT, EAAC, EAAT4 og EAAT5). Når det gjelder lokaliseringen av disse i hjernevev, har man minst informasjon om EAAC og EAAT5. De eneste kvantitative elektronmikroskopiske data på distribusjonen av EAAC i hjernevev (He et al., 2000) er fra hippocampusregionen CA1 (stratum radiatum) og er usikre fordi merkingen i vevet var svak. I henhold til dette studiet er den høyeste tettheten av EAAC ved siden av de postsynaptiske fortetningene (PSD). Aud Skår fra vår gruppe (upublisert, hovedfagsoppgave 2002) studerte EAAC i hippocampusregionen CA3 (stratum radiatum og stratum lucidum) og fant at hovedmengden av merkingen var i PSD. Målet med denne oppgaven, var å finne ut om forskjellene i PSD-merking skyldes forskjeller mellom ulike subregioner av hippocampus eller om det hadde andre årsaker. Vev fra CA1 regionen ble undersøkt med alle tilgjengelige antistoffer mot EAAC, og alle antistoffene gav PSD-merking. Antistoffer mot GLAST og GLT ble brukt som kontroller, og gav ingen PSD-merking. Det gjorde heller ikke antistoff fra preimmunserum. Hjernevev fra genmodifiserte mus som manglet EAAC (KO-mus), villtype mus (WT-mus) og Wistar rotter ble løst opp i SDS, separert ved elektroforese i geler laget med 10 % akrylamid og immunblottet. Antistoffene virket spesifikke for EAAC. Imidlertidig gav antistoffene merking på fiksert vev fra hippocampus og striatum fra KO-musene. Elektronmikroskopisk analyse viste at merkingsmønsteret var det samme. Elektroforese i 10 – 20 % gradientgeler viste at antistoffene kryssreagerte med to små molekyler (ca 10 – 15 kDa) som ikke var synlig på de første immunblottene. Det ble også gjort forsøk på å få indirekte informasjon om distribueringen til EAAC ved å se på distribueringen til et EAAC-bindende forankringsprotein, GTRAP3-18. Dette krevde tilgang til anti-GTRAP3-18 antistoffer som verken vi eller andre grupper til nå har klart å fremskaffe. Konklusjon: Forskjellene mellom funnene til He og medarbeidere (2000) og Aud Skår skyldes antagelig antistoffene, men dette studiet kan verken bekrefte eller avkrefte konklusjonene til He og medarbeidere, og er en demonstrasjon på hvor vanskelig det er å bli sikker på hva antistoffene faktisk merker i fiksert vev.