Proteomisk identifisering av fosfoproteiner : En metodologisk undersøkelse

Abstract

Autofagi er en viktig proteindegraderingsmekanisme i eukaryote celler, da den er hovedmekanismen for nedbrytning av cytosoliske proteiner og organeller når tilgangen på næringsstoffer er begrenset. I tillegg er autofagi foreslått å være involvert i en rekke andre cellulære prosesser. Degraderingsveiens strukturelle og funksjonelle trekk er godt beskrevet gjennom flere tiår med forskning. De molekylære mekanismene var derimot relativt ukjent fram til begynnelsen av 90-tallet da studier av gjærmutanter, som var defekte i autofagi, bidro til en stadig økende kunnskap om det molekylære maskineriet i denne celletypen. Forskningen på gjærmutantene har bidratt til å karakterisere individuelle proteiner involvert i autofagi, og har gitt innsikt i hvordan flere av enkeltkomponentene interagerer med hverandre. Ved komparative studier av gensekvenser har en identifisert en rekke homologer av disse gjærmutantene i høyere eukaryoter. Hvor i autofagiprosessen proteinene utøver sin funksjon, og hvordan de utfører den er fortsatt relativt ukjent. Seglens forskningsgruppe på Det norske radiumhospital har fra tidlig på 70-tallet forsket på strukturelle og funksjonelle aspekter av autofagi i animalske celler ved å bruke en rekke forbindelser som regulerer aktiviteten til prosessen. Ved å benytte disse forbindelsene, sammen med proteinspesifikke antistoff, har gruppen studert reguleringen av autofagi på proteinnivå i rottehepatocytter. Hvilke signalveier som er involvert i reguleringen er fortsatt ukjent, men Seglens gruppe har vist at hemming av autofagi korrelerer med fosforylering av en rekke proteinkinaser og deres substrater. Det initielle signaliseringstrinnet i prosessen er derfor trolig regulert av fosforyleringskaskader, noe som understøttes av at flere av gjærmutantene antatt å være involvert i dette trinnet er fosfoproteiner. Målet med oppgaven var å utvikle en proteomisk metode for identifisering av fosfoproteiner. To proteinkinaser, AMP-avhengig proteinkinase (AMPK) og 70 kDa S6 kinase (p70 S6K), ble valgt som modellproteiner av flere grunner. Tidligere forsøk på gruppen har vist at fosforylering av AMPK i aktive sete, og fosforylering av p70S6K i regulerende del, korrelerer med hemming av autofagi når en benytter en adenosinanalog eller ulike proteinfosfatasehemmere. Begge proteinkinasene er velkjente komponenter i regulering av en rekke cellulære prosesser, og er i tillegg foreslått å være involvert i signalveier som kontrollerer autofagi. Andre kriterier som var viktige for valget av de to proteinkinasene var at det var gode kommersielle antistoffer tilgjengelig og at proteinenes fysiokjemiske egenskaper ble vurdert å være ideelle for oppløsning på 2D-geler. De proteomiske metodene benyttet var den klassiske kombinasjonen innen feltet, 2D-gelelektroforese og massespektrometri.