| dc.description.abstract | Transcobalamin (TC) er et protein på 45,5 kDa som finnes i blodbanen til pattedyr. TC transporterer de to kofaktorene til vitamin B12, metyl- og 5 -deoksyadenosyl-cobalamin, til kroppens celler etter opptak fra tarm. Man antar at alle celler har reseptorer for TC da endocytose av holoTC er den måten 99 % av vitamin B12 kommer seg inn i cellene på og bare 1 % diffunderer passivt over cellemembranen (Engstedt et al., 1998). Intracellulært deltar cobalamin i viktige reaksjoner i forbindelse med metabolisme av fettsyrer og aminosyrer og syntese av DNA. Redannelse av kroppens S-adenosylmetionin (SAM), et meget viktig metylerings-reagens, krever også cobalamin (Voet et Voet, 1995).
Valensen eller det totale antall antistoff som kan binde til rekombinant humant TC samtidig i løsning ble bestemt til å være fire. Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom apo- og holoTC i denne forbindelse.
Det skulle søkes etter konformasjonelle epitoper og det ble derfor utført kartlegging av holoTC med hensyn på kobinding av de fleste tilgjengelige monoklonale antistoff (mAb) ved hjelp av biomolekylær interaksjonsanalyse og immunoutfelling i gel. Det ble på denne måten funnet fem distinkte epitoper på holoTC definert ved hjelp av grupper av mAb som binder til de forskjellige epitopene: mab3-9 binder til epitop 1, mAb2-2, 3-11, 4-7, 5H2 og TC7 binder til epitop 2, mAbTC4 binder til epitop 3, mAb3C4 og TC2 binder til epitop 4 og mAb3C12 binder til epitop 5. I tillegg har det blitt funnet en 6. epitop for mAbQ2-2 og epitop 2 har blitt delt i to ved hjelp av inhibisjonsstudier med heparin og oligonukleotid (Lars Örning, personlig kommunikasjon.
Det skulle letes etter lineære epitoper etter fragmentering av humant TC med CNBr som kutter på C-siden av metionin og deler TC opp i 12 fragmenter. Test på Western blot gav antigene peptider etter test mot mAb og pAb. Ser man på membranen som et fingeravtrykk i.e. også betrakter de ufullstendig spaltede fragment, var membranene til mAb2-2, mAb3-11 og mAb4-7 svært like mens mAb3-9 skilte seg merkbart ut. Dette samsvarer med at mAb3-9 tilhører epitop 1 og mAb2-2, 3-11 og 4-7 tilhører epitop 2 i henhold til til biomolekylær interaksjonsanalyse. Fem antigene bånd ble funnet etter test mot pAb og ett bånd etter test mot ulike mAb: mAb3-9, mAb2-2, mAb3-11 og mAb4-7. Et bånd på ca. 11 kDa var antigent for alle disse antistoffene, men båndet var inhomogent og bestod delvis av det ufordøyde fragmentet med posisjonsintervall 316 427 (LEPAA MGKAAG ) med teoretisk masse på 12,3 kDa og delvis av fragmentet i posisjonsintervallet 103 198 (GQLAL ) på 10,9 kDa. MAb ene 2-2, 3-11 og 4-7 gjenkjenner posisjonsintervallet 103 198 (GQLAL ), mens mAb3-9 gjenkjenner posisjonsintervall 316 427 (LEPAA MGKAAG ). De hydrofile regioner i disse fragmentene, i henhold til hydrofobisitetsplott à la Kyte og Doolittle (1982), og hvor det derfor er størst sannsynlighet for å finne epitopene er i) 117 131 ii) 133 158 iii) 168 176 og iv) 185 for posisjonsintervallet 103 198 (GQLAL ) og i) 320 329 ii) 342 348 iii) 357 381 iv) 388 406 og v) 410 422 for posisjonsintervall 316 427 (LEPAA MGKAAG ).
Mab5H2 skilte tydelig mellom apo- og holoformen av TC, med preferanse for holoTC, både på biomolekylær interaksjonsanalyse og i forsøk med magnetiske mikrosfærer. I og med at cellereseptorene også skiller mellom på apo- og holoTC er denne reseptoren muligens partielt paratopisk analog med dette mAb. Ingen antistoff bandt til cyanocobalamin per se slik at preferansen for holoformen skyldes antagelig konformasjonsendring av TC etter binding av cyanocobalamin.
Polyklonalt antistoff fra kanin mot humant TC ble testet mot holoTC fra rotte, ku, mus, hest, sau og gris. Kryssreaktiviteten til TC var økende i rekkefølgen gris, sau, hest, mus, ku og rotte. For mAb ene viste kun mAb2-2 kryssreaktivitet, på to ganger bakgrunn, i tilfellet bovint TC. Deler av epitopen som mAb2-2 bindes til på humant TC er altså tilstede på bovint TC. Aminosyresekvensene som er like i de to artene, samtidig som de er hydrofile er i) KGDRLVSQLK med posisjonsintervall: 123 132 ii) FLEDEKRAIGH med posisjonsintervall 134 144 og iii) HQKRVHDSVV med posisjonsintervall: 167 176.
Assosiasjonskonstantene KA til mAb2-2, 3-9, 3-11 og 4-7 ble bestemt til å være henholdsvis 1,2, 2,4, 1,3 og 0,6 x 10E10 L/mol med hensyn på innbinding av holoTC og henholdsvis 0,4, 3,8, 0,8 og 0,2 x 10E10 L/mol med hensyn på innbinding av apoTC. Dette ble utført med biomolekylær interaksjonsanalyse på en Biacore-maskin. | nor |