Understanding the cell surface interactions of enterotoxicenic Escherichia coli

Abstract

Varmelabilt enterotoxin (LT) er den viktigste virulensfaktoren for det bakterielle patogenet enterotoxigent Escherichia coli (ETEC), som er ansvarlig for reisediaré i utviklingsland. LT består av en enzymatisk aktiv A-underenhet og en smultringformet B-pentamer. B-pentameren er ansvarlig for binding av toksinet til epitelceller i tarmsystemet. Den primære cellereseptoren til LT, GM1, bindes i det primære bindingssetet, på undersiden av B-pentameren mellom to tilstøtende B-subenheter. Denne bindingsinteraksjonen mellom toksinet og vertscellen er nødvendig for internalisering og transport inne i cellen, og til slutt forårsake diaré. Nyere studier har identifisert et sekundært, uavhengig bindingssete i LTB fra humant isolat (hLTB) som er ansvarlig for binding av blodgruppe-determinanter. Dette bindingssetet befinner seg også i overgangen mellom to B-subenheter, men med god avstand fra det primære bindingssetet. Det har også blitt foreslått at dette sekundære bindingssetet overlapper med bindingssetet til lipopolysakkarider (LPS). Bedre forståelse av hvordan LTB interagerer med ligander på celleoverflaten i tarmsystemet kan forbedre den medisinske forståelsen av infeksjon og prosesser i immunforsvaret. En videre konsekvens av dette vil være utvidede muligheter for utvikling av ny og bedre medisinsk behandling, inkludert vaksiner mot reisediaré.

I denne oppgaven har B-pentameren fra hLT blitt isolert og renset. Proteinet har blitt brukt til krystallisering i kompleks med LPS, eller mindre deler av oligosakkarid-delen til LPS. I tillegg har det blitt utført bindingsstudier, hovedsakelig ved ELISA eksperimenter, men også ved Surface Plasmon Resonance (SPR), for å undersøke eventuell konkurrerende bindig mellom LPS og blodgruppe antigener i det sekundære bindingssetet, og mellom binding av GM1 og blodgruppe-determinanter i henholdsvis det primære og sekundære bindingssetet.

Det har også blitt dannet krystaller av hLTB, og to datasett har blitt samlet fra krystaller ”soaket” med 2-keto-3-deoxyoctonate (keto) og D-glucoheptose. Strukturer har blitt løst fra begge datasettene med oppløsning på ca. 3 Å. Det har blitt observert ekstra elektrondensitet i det sekundære bindingssetet som kan tyde på at sukkermolekylene har bundet seg til proteinet, men det er ikke nok bevis til å trekke endelige konklusjoner. Bindingsstudiene antyder at binding av LPS hindrer binding av hLTB til blodgruppe-antigener. Videre har det blitt vist at binding av blodgruppe determinanter i sekundært bindingssete blir hindret når GM1 er bundet i det primære bindingssetet, mens antigenene selv ikke har noen innvirkning på bindingen til GM1.

The heat-labile enterotoxin (LT) is the major virulence factor of the bacterial pathogen enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), which is responsible for “traveller’s diarrhoea” in developing countries. LT consists of an enzymatically active A-subunit and a doughnut-shaped B-pentamer. The B-pentamer is responsible for binding of the toxin to the epithelial cells of the intestine. The primary cellular receptor for LT is GM1, which binds at the primary binding site, located on the bottom of the B-pentamer at the interface between adjacent B-subunits. This binding interaction is critical for the binding of the toxin to host tissues, internalization and transport within the target cell, and ultimately for inducing diarrhoea. More recent studies have identified a second binding site in LTB of human isolates (hLTB), responsible for binding blood group determinants. This binding site is also situated at the interface between two B-subunits, but distinct from the primary binding site. It has been suggested that this secondary binding site overlaps with the binding site for lipopoloysaccharide (LPS). A better understanding of the ability of LTB to interact with intestinal cell surface ligands can improve the medical understanding of the mechanism of infection and immune response processes. This can in turn be useful for the development of new medical treatment and vaccines against travellers’ diarrhoea.

In this study, the B-pentamer of hLT has been prepared and purified. The protein has been used for crystal structure studies in complex with LPS and smaller parts from its oligosaccharide portion. In addition, binding studies have been conducted, primarily by ELISA, but also with Surface Plasmon Resonance (SPR), to investigate possible competition between LPS and blood group antigens for binding to the secondary binding site, and between GM1 and blood group antigens in the primary and secondary binding sites, respectively.

Crystals of hLTB have also been obtained, and two data sets have been collected from the crystal soaked with 2-keto-3-deoxyoctonate (keto) and D-glucoheptose. Structures have been solved from both datasets at ca. 3 Å resolution. Some evidence of ligands binding observed in the secondary binding site, but the quality of the difference electron density is too poor for final conclusions. The binding studies give preliminary evidence that LPS binding probably inhibits binding of hLTB to blood group antigens. They have further revealed that binding of GM1 in the primary binding site inhibits binding of blood group determinants A, B and H in the secondary binding site, while the blood group antigens have no such inhibitory effect with respect to binding of GM1.