Isolering og karakterisering av et operon for chaperoner fra bakterien Chloroflexus aurantiacus

Abstract

Genet som koder for chaperoninet GroESL1 i C. aurantiacus ble isolert fra et genomisk bibliotek av bakterien. Genet som koder for GroESL2 var tidligere isolert fra det samme biblioteket (Vanberg, Hovedfagsoppgave UiO, 2001) ved hjelp av PCR. Denne metoden ble derfor valgt. Da oppgaven ble påbegynt var ikke genomet til C. aurantiacus ferdigsekvensert, men en stor del av genomet lå ute på NCBI som ”shot-gun” sekvenser. Imidlertid var noe av sekvensen til groESL1 allerede kjent, Chlo_724 (figur 4.20) var på 1430 bp. Da promoterområdet til operonet og groES1 utgjorde 582 av disse basene, og forventet størrelse til groEL1 var ca. 2000 bp, manglet sekvensen ca. 1000 bp. Spesifikke primere for genet ble utformet og en PCR basert søkemetode etter King (1997) sammen med en noe modifisert metode etter Yu og Bloem (1996) ble brukt. Med disse metodene ble flere positive fagkloner isolert fra biblioteket. Innskuddene fra de positive fagklonene ble videre analysert med PCR med kombinasjonen av vektorspesifikke primere og genspesifikke primere for å finne ut om hele groESL1 var tilstede i innskuddet. Sekvenseringen av innskuddene ble gjort av firmaene GATC og MWG. Flere innskudd ble isolert og sekvensert, men den fullstendige sekvensen til groESL1 ble ikke funnet. En klon, kalt Plakk2, ga en fortsettelse av sekvensen Chlo_724 på ca. 800 bp. Denne sekvensen ble analysert i programmet WebCutter. I dette programmet ble sekvensen kuttet in silico med restriksjonsenzymet Sau3AI, som var enzymet som var brukt til å kutte genomisk DNA fra C. aurantiacus da biblioteket ble konstruert. Resultatet av analysen viste 17 kutteseter i området der sekvensene sluttet. Høsten 2004 ble genomet til C. aurantiacus ferdig sekvensert og lagt ut på databasene til NCBI som en ”shot gun” sekvens i form av ”contigs”, delsekvenser. Siste del av Plakk2, omtrent 200 bp, ble brukt i BLAST søk. En klon, Chlo01_574 viste 100 % sekvenslikhet med den siste delen av Plakk2. Sekvensen som ligger mellom det som var kjent fra før og den siste delen av Plakk2 var imidlertid ikke å finne i databasen. Muligens var det her et glipp i sekvenseringen fra TIGR. Sekvensen ble satt sammen så de utgjorde hele operonet groESL1 (figur 4.24). Sekvensen til genet var på 2228 bp og inneholdt stopp-kodonet TAA. Sekvensen ble oversatt til proteinsekvens og molekylvekten beregnet ved hjelp av programmet ExPacy. Molekylvekten på dette proteinet var 59,7 kDa. Det ble utformet primere for å isolere hver av de to genene i operonet, groES1 og groEL1, ved hjelp av PCR. Primersettene ble brukt både med kromosomalt DNA fra og biblioteket som templat. Primersettet til groES1 ga gode resultater med begge templatene, primersettet til groEL1 ga kun resultat med kromosomalt DNA som templat. Dette styrket teorien om at hele sekvensen til groEL1 ikke var å finne i en klon. PCR produktene ble sekvensert og viste seg å stemme med sekvensene i operonet. De to genene skulle uttrykkes og ble derfor satt inn i hver sin pET vektor som ble brukt til å transformere BL21 Star celler. Det viste seg at det bare var groES1 som ble uttrykt på denne måten. Sekvensen til groEL1 ble videre analysert i programmet Rare Codon Calculator der det ble funnet at dette genet hadde i alt 14 sjeldne kodoner for aminosyrene prolin og arginin. Sjeldne kodoner kan være årsaken til at genet ikke blir uttrykt, eller at det blir for tidlig terminering av heterologe gener. Det ble derfor forsøkt å uttrykke groEL1 i vertscellen BL21-CodonPlus (DE3) RP. Stammen BL21-CodonPlus (DE3) RP inneholder ekstra kopier av argU og proL, genene som koder for tRNA som gjenkjenner kodonene AGA og AGG for arginin og kodonet CCC for prolin. Da IPTG indusert celleekstrakt fra disse cellene ble analysert på SDS-PAGE, viste det seg at et protein på 60 kDa var uttrykt.